HCV核心蛋白在HEPG2细胞中对COX2表达的影响.pdf
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1、I S S N 1 0 0 7 一 8 7 3 8 细胞与分子免疫学杂志( C h i n J C e l l M o l I m m u n o l ) 2 0 0 6 , 2 2 ( 3 ) 3 4 3 论著 文章编号: 1 0 0 7 一 8 7 3 8 ( 2 0 0 6 ) 0 3 一 0 3 4 3 一 0 3 H C V核心蛋白在H e p G 2 细胞中对 C O X - 2 表达的影响 刘艳丽, 闰岩, 白文涛, 张芳琳, 吕 欣, 张伟, 徐志凯* ( 第四 军医 大 学微生 物学教 研 室, 陕 西西 安7 1 0 0 3 2 ) T h e e f f e c t o
2、f H C V c o r e p r o t e i n o n t h e e x p r e s s i o n o f c y c l o o x y g e n a s e 2( C O X - 2 ) i n H e p G 2 c e l l s L I U Y a n - l i , Y A N Y a n , B A I W e n - t a o , Z H A N G F a n g - l i n , L U X i n , Z H A N G W e i , X U Z h i - k a i * D e p a rt m e n t o f M i c r o b
3、i o l o g y , F o u rt h M i l i t a r y M e d i c a l U n i v e r s i t y , X i a n 7 1 0 0 3 2 , C h i n a A b s t r a c t A I M: T o in v e s t ig a t e t h e e ff e c t o f H e p a t it is C v i r u s( H C V ) c o r e p r o t e in o n t h e e x p r e s s io n o f c y c lo o x y g e n - a s e 2 (
4、 C O X - 2 ) . ME T H O D S : T h e g e n e s e n c o d e d H C V c o r e p r o t e in w e r e a m p lif ie d f r o m p la s m id c o n t a in in g f u ll le n g t h g e - n o m e o f H C V s t r a in H 7 7 u s in g P C R , a n d w e r e c lo n e d in t o e u k a r y o t ic e x p r e s s io n v e c
5、t o r p c D N A 3 . 1 .T h e r e c o m b in a n t H C V - C / p c D N A 3 . 1 w a s t r a n s ie n t ly c o - t r a n s f e c t e d i n t o H e p G 2 c e lls w it h lu c if e r a s e r e p o rt e r v e c t o r c o n t a in in g C O X - 2 p r o - m o t o r ( C O X 2 p r o l . 5 k b / lu c ) .T h e lu
6、 c if e r a s e a c t iv it y a n d C O X - 2 p r o t e in e x p r e s s io n w e r e d e t e c t e d . R E S U L T S : T h e r e o m b in a n t s H C V - C / p c D N A 3 . 1 h a v e b e e n c o n s t r u c t e d s u c - c e s s f u lly . T h e lu c if e r a s e a c t iv it y o f C O X - 2 p r o m o
7、 t o r w a s a c - t iv a t e d b y t h e e x p r e s s e d H C V c o r e , a n d t h e in c r e a s e d p r o - t e i n e x p r e s s io n o f C O X - 2 i n t r a n s f e c t e d H e p G 2 c e l ls w a s d e - t e c t e d b y We s t e r n b l o t . C O N C L U S I O N: H C V c o r e p r o t e in c
8、a n a c t iv a t e t h e C O X - 2 p r o m o t o r a n d in d u c e it s e x p r e s s io n , w h ic h p r o v id e s a n e w e x p e r i m e n t a l b a s is f o r f u rt h e r r e s e a c h o n r e l a t io n s h i p b e t w e e n C O X - 2 a n d H C V p a t h o g e n e s is . K e y w o r d s H C
9、V ; c o r e p r o t e in ; C O X - 2 摘 要 目的: 研究丙型肝炎病毒( H C V ) 核心蛋白是否影 响环氧化酶- 2 ( C O X - 2 ) 的表达。方法: 用 P C R从含 H C V H 7 7 株全长基因组序列质粒中扩增H C V核心蛋白 基因, 并克隆至 p c D N A 3 . 1 载体中, 构建H C V 核心蛋白 基因的真核表达载 体 H C V - C / p c D N A 3 . 1 。用H C V - C / p c D N A 3 . 1 和含C O X 一启动子 的荧光素酶报告载体C O X 2 p r o 1 . 5
10、 k b / l u c 瞬时共转染H e p G 2 细胞, 测定萤火虫荧光素酶的活性, 并用 W e s t e rn b l o t 检测 C O X - 2 蛋白的表达水平。结果: 成功地构建了H C V - C / p c D - N A 3 . 1 重组质粒。瞬时转染后的H e p G 2 细胞中, C O X 2 启动 收稿日 期: 2 0 0 5 一 1 0 - 1 7 ; 修回日期: 2 0 0 5 一 1 2 - 2 9 基金项目: 国家自 然科学基金资助项目( N o . 3 0 3 7 1 2 8 0 ) 作者简介: 刘艳丽( 1 9 8 0 一) , 女, 山西临汾人
11、, 助教, 硕士. T e l ; ( 0 2 9 ) 8 4 7 7 4 5 2 6 ; E m a i l ; l i u h 3 0 6 y a h o o . c o m . c n * C o r r e s p o n d i n g a u t h o r 子荧光素酶的活性显著增强。W e s t e rn b l o t 检测, 发现C O X - 2 的表达明显升高。结论: H C V核心蛋白在H e p G 2 细胞中激活 C O X 一启动子, 并且明显诱导C O X 一的表达, 为进一步研究 C O X 一与H C V 致 病 性的 关系 提供了 新的实 验依据。 关键
12、词丙型肝炎病毒; 核心蛋白; 环氧化酶一 2 【 中图分类号8 3 7 3 文献标识码 A 丙型肝炎病毒( H C V ) 致慢性感染、 肝硬化和肝 癌的机制仍不清楚, 病毒的持续感染与机体免疫状 况以及病毒和机体的相互作用有关。病毒感染可激 活多种信号通路并影响炎症相关基因, 如诱导型一 氧化氮合酶( i N O S ) 基因, 环氧化酶一( c y c l o o x y g e n - a s e - 2 , C O X - 2 ) 基因和干扰素( I F N ) 等 1 , 2 的表达。 C O X是前列腺素( P G s ) 合成过程中的限速酶, 可将 花生四烯酸转变为P G H 2
13、 , 并可进一步转化为其他前 列腺素如P G E 2 o C O X有两种同工酶C O X - 1 和C O X - 2 0 C O X - 1 在大多数细胞中持续表达, 并参与维持机体 正常的生理功能; 而C O X - 2 在正常组织中通常不表 达, 只有受促有丝分裂原、 细胞因子和其他因素刺激 的 细胞中才被诱导表达团。 近年的研究显示, 多种 肿瘤组织中C O X 一的过度表达与肿瘤发生密切相关。 H C V阳性的慢性肝炎、 肝硬化和H C C患者肝组 织中C O X 一的表达明显高于正常组织或癌旁正常组 织, 提示C O X 一的过度表达在H C V病毒致病过程中 起一定作用。H C
14、 V核心蛋白具有多种生物学功能, 可调节多种细胞基因的表达, 影响宿主细胞凋亡和 免疫系统功能, 对病毒持续性感染和H C C的发生起 重要作 用 4 。 本研究旨 在探索H C V 核心蛋白 是否可 影响C O X 一的表达, 为进一步阐明其在 H C V致病过 程中的作用奠定一定的理论基础。 1 材料和方法 1 . 1 材料 大肠杆菌D H 5 a和载体p c D N A 3 . 1 由本室保存。 含H C V全长基因组序列的质粒 H / F L由美国洛克菲勒大学 R i c 。 教 授 提供 5 o C O X - 2 启动子萤火虫荧光素酶报告载体 ( C O X 2 p r o l .
15、 5 k b / l u c ) 为将约1 . 5 k b C O X - 2 启动子区( 一 1 4 3 2 一+ 1 0 4 ) 克隆人p G L I I , 由 本室构建。 作为内参对照的R e n i l - l a 荧光素酶报告载体购自P r o m e g a 公司。H e p G 2 ( h e p a t o b l a s - t o m a , 肝母细胞癌)由本科室保存。R P M 1 1 6 4 0 购自G ib c o 公 司。新生牛血清购 自杭州四季青生物材料工程有限公司。 3 4 4 I S S N 1 0 0 7 一 8 7 3 8 细胞与分子免疫学杂志( C h
16、 i n 3 C e l l M o l I m m u n o l ) 2 0 0 6 . 2 2 ( 3 B a M H I 和X b a 1 为,T a k a r a 公司产品。引物由上海博亚公司合 成。质粒小量提取试剂盒购自 博亚公司。质粒大量提取试剂 盒、 凝胶回收试剂盒及L u c i f e r a s e 分析试剂( D u a l - L u c i f e r a s e R e p o rt e r A s s a y S y s t e m ) 购自P r o m e g a 公司。L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 转染试剂购自I n
17、 v i t r o g e n 公司。胰蛋白脉及酵母提取物购自 宝泰克公司。 兔抗C O X - 2 ( H - 6 2 ) 抗体购自S a n t a C r u z B i o t e c h - n o l o h g y 公司。红外荧光标记的羊抗兔I g G购自R o c k l a n d 公 司。其余试剂均为国产分析纯。 、1 . 2 方法 2 . 1 H C V核心蛋白基因的扩增及真核表达载体的构建 根据G e n B a n k 中H C V的核昔酸序列, 设计引物, 其序列如 下:正 义 链 为:5 - G T G G A T C C G C C A T G A G C A
18、 C G A A T C C T A - A A C C - 3 ( 划线处为B a m H I 的酶切位点) 。反义链为: 5 - G T - 工 旦 工 鑫 旦 鑫 TTA G G C T G A A G C G G G C A C A G - 3 ( 划线处为X b a I 的 酶切位点) 。用P C R扩增H C V核心蛋白基因, 扩增反应体系 为H / F L 模板微量, 1 0 x T a q B u f f e r 5 N ,L , 2 5 m m o l/ L M g C l , 3 R L , 2 . 5 m m o V L 4 x d N T P 2 p ,L 、 上下游引
19、物各2 0 p m o U L , 加无 菌纯 水至 终体积为5 0 w L 。 反 应条 件为: 9 5 9 0 1 0 m i n , 温 度维持在8 0 加T a q D N A 聚合酶1 w L ( 5 U / p ,L ) 1 m i n , 扩 增9 4 9 0 4 5 s , 5 0 9 C 4 5 s , 7 2 9 C I m in , 共3 5 个循环后, 再于 7 2 延伸1 0 m i n , 置4 冷却。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳 鉴定后, 依次经酚/ 氯仿抽提、 乙醇沉淀、 B a m H I 和X b a I 双 酶切过夜, 将回收纯化后的P C R 产物, 与用B
20、 a m H I 和X b a I 双 酶切、 低 熔点 琼脂 糖凝胶回 收的 载体p c D N A 3 . 1 于1 6 连 接过夜, 取连接 产物2 p .L 用电 穿孔法转化E . c o l i D H 5 a_ , 接 种于2 x Y T 培养基, 随机挑取单克隆个菌落, 用试剂盒提取 质粒, 并经B a m H I , X b a I 双酶切鉴定后, 送博亚公司测序证 实, 命名为H C V - C / p c D N A 3 . 1 0 1 . 2 . 2瞬时转染和荧光素酶报告载体的活性测定将 H e p G 2 细胞培养于含1 0 0 m UL 新生牛血清的完全R P M 1
21、 1 6 4 0 ( p H值7 . 1 一 7 . 4 ) 培养基, 置于3 7 9 0 、 5 0 m UL C 0 2 培养箱中 培养。 取2 x 1 护个H e p G 2 细 胞接种于1 2 孔板中, 待细胞长 至9 0 % 一 9 5 %汇合时, 按 I n v i t r o g e n 公司L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 R e a g e n t 试剂说明书进行转染。转染质粒用P r o m e g a 公司质粒 大 量提取 试剂盒 提 取, 以2 W g 的H C V - C / p c D N A 3 . 1 + 0 . 8 p ,g
22、C O X 2 p r o 1 . 5 k b / l u c + 0 . 0 4 W g 的R e n il l a 荧 光 素 酶 报 告载 体为 试验孔, 以2 w g 的p c D N A 3 . 1 + 0 . 8 ji g C O X 2 p r o l . 5 k b / l u c + 0 . 0 4 p ,g 的R e n i l l a 荧光素酶报告载体为无H C V核心蛋白阴性 对照孔, 以2 w g H C V - C / p c D N A 3 . 1 十 萤火虫荧光素酶报告载 体p G L II ( 无启动子空载体) + 0 . 8 p g C O X 2 p r
23、o l . 5 k b / l u c + 0 . 0 4 p ,g 的R e n i l l a 荧光素酶报告载体为无启动子阴性对照 孔, 每孔加3 IL L L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 R e a g e n t 的用量。转染后 6 h , 换成含 1 0 0 m UL 新生牛血清、 无抗生素的R P M 1 1 6 4 0 培 养液。 转染2 4 h 后收集细胞, 参照P r o m e g a 公司的D u a l - L u - c i f e r a s e R e p o rt e r A s s a y S y e t e m试剂盒中 的
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- 关 键 词:
- HCV 核心 蛋白 HEPG2 细胞 COX2 表达 影响
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