GM-1对大鼠局灶性脑缺血再灌注后FAS蛋白的表达与细胞凋亡的影响.pdf
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1、第 3 9 卷第 4 期 2 0 0 5年 8月 哈尔滨医科大学学报 J O U R N A L O F H A R B I N ME D I C A L U N I V E R S I T Y V o l . 3 9 , N o . 4 A u g . , 2 0 0 5 3 3 5 G M - 1 对大鼠局灶性脑缺血再灌注后 F a s 蛋白 的表达与细胞凋亡的影响 张援月 ,赵景霞z ,张海英, ( 1 . 唐山市工人医院 急诊科; 2 . 华北煤炭医学院 基础部,河北 唐山0 6 3 0 0 0 ; 3 . 哈尔滨医科大学第二临床医学院,黑龙江 哈尔滨 巧 0 0 8 6 ) 摘要 目
2、的 研究大鼠脑缺血再灌注后凋亡相关基因F a s 在海马区表达的变化, 进一步探讨脑缺血再灌注后细 胞凋亡的机制和 G M - 1 的脑保护作用。方6 # 线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型, 同时给予 G M - 1 治疗, 采 用T U N E L 和免疫组化方法观察细胞凋亡及 F a s 蛋白在脑缺血再灌注后的变化规律。祛果脑缺血再灌注后海马 区神经细胞过度地表达F a 。 蛋白, 并且该区出现明显的神经细胞凋亡; G M - 1 能够使F a s 蛋白的表达高峰及神经细胞 凋亡高峰下调。祛i c F a s 的过度表达可能是脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的重要原因。G M - 1 可能通
3、过抑制 F a s 的表达, 减少神经细胞凋亡发挥脑保护作用。 关键词 脑缺血再灌注; 海马F a s 蛋白; 细胞凋亡; G M - 1 中图分类号 R - 3 3 2 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 0 一 1 9 0 5 ( 2 0 0 5 ) 0 4 一 0 3 3 5 一 0 2 T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h ee x p r e s s i o no f F a s p r o t e i n a n d a p o p t o s i sa f t e r c e r e b r a l i s c h e
4、m i a a n d r e p e r f u s i o n i n r a t s a n d t h e r o l e o f G M- 1 Z H A N G Y u a n - y u e , Z H A O J i n g - x i a , Z H A N G H a i - y i n g ( D e p a rt m e n t of E m e r g e n c y , T a n g S h a n W o r k e r : H o sp i t a l , T a n g S h a n 0 6 3 0 0 0 , C h i n a ) A b s t r
5、a c t : O 讨e c t i v e T o s t u d y t h e m e c h a n i s m o f a p o p t o s i s a f t e r c e r e b r a l i s c h e m i a a n d r e p e r f u s i o n i n r a t s a n d t h e r o l e o f G M - 1 t h r o u g h o b s e r v i n g t h e e x p r e s s i o n o f F a s p ro t e i n a n d a p o p t o s i
6、s i n h i p p o c a m p u s . Me t h o d s T h e f o c a l i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n m o d e l w a s m a d e b y t h r e a d e m b o l i s k o f m i d d l e c e r e b r a l a r t e ry, a n d t r e a t e d w i t h G M - 1 , o b s e r v e d t h e e x p r e s s i o n o f F a s p r o t e i
7、 n a n d a p o p t o t i c c e l l d e a t h b y u s i n g i n s i t u h y b r i d i z a t i o n a n d t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a s f e r a s e - m e d i a t e d d U T P - b i o t i n i n s s i t u n i c k e n d l a b e l i n g ( T U N E L )t e c h n i q u e . R e s u l t
8、s I n - c r e a s e d e x p r e s s i o n o f F a s p r o t e i n a n d i n c r e a s e d a p o p t o t i c c e l l s i n h i p p o c a m p u s a f t e r c e r e b r a l i s c h e m i a a n d r e p e r f u s i o n w e r e o b s e r v e d . G M - 1 c o u l d d e c r e a s e t h e e x p r e s s i o n
9、o f F a s p r o t e i n a n d a p o p t o t i c c e l l d e a t h C o n c l u - s i o n T h e i n c re a s e d e x p r e s s i o n o f F a s p r o t e i n m a y b e t h e i m p o r t a n t c a u s e o f a p o p t o t i c c e l l d e a t h a f t e r c e re b r a l i s c h e m i a a n d re p e r f u s
10、 i o n . G M - 1 m a y p l a y a p ro t e c t i v e ro l e b y d e c r e a s i n g t h e e x p re s s i o n o f F a s p r o t e i n a n d a p o p - t o t i c c e l l d e a t h . K e y w o r d s : c e r e b r a l i s c h e m i a a n d r e p e r f u s i o n ; h i p p o c a m p u s ; F a s p r o t e i
11、n ; a p o p t o s i s ; G M - 1 近几年来, 大量的研究表明脑缺血再灌注后海 马区出现神经细胞凋亡, 其发生机制尚不十分清楚。 细胞凋亡的发生是一个主动的细胞死亡过程, 是由 基因调控的。凋亡相关的基因通常分为两大类, 即 抗凋亡基因和促凋亡基因。F a s 为目前发现的最重 要的促凋亡基因之一。本文就大鼠脑缺血再灌注后 海马区F a s 蛋白的表达和细胞凋亡的产生进行研 究。同时, 给予神经节昔脂( G M - 1 ) 进行治疗, 探讨 G M - 1 的脑保护作用。 1 材料与方法 收稿日 期 2 0 0 5 一 0 5 一 2 2 作者简介 张援月( 1 9
12、 6 2 一) , 男, 河北唐山人, 副主任医师。 *通讯作者 1 . 1 动物及分组 取 2 5 0 只成年雄性健康 W i s t a r 大鼠随机分成脑 缺血再灌注组( 8 0只) 、 生理盐水组( 8 0只) 及 G M - 1 治疗组( 8 0 只) , 每组又分别划分为伤后 3 , 6 , 1 2 , 2 4 , 万方数据 3 3 6哈尔滨医科大学学报第 3 9 卷 4 8 , 7 2 , 1 6 8 , 3 3 6 h 等8 个时相组, 正常对照组( 1 0 只) 。 1 . 2方 法 1 . 2 . 1 动物模型制备: 线栓法 I 制作大鼠大脑中动 脉梗阻再灌注模型, 于左侧
13、颈总动脉分叉处做一切 口, 插人直径0 . 2 3 m m尖端蘸有石蜡的单股尼龙线, 经颈内动脉人颅, 遇阻力后稍退出0 . 5 m m, 插人深度 约为( 1 . 7 9 5 士 0 . 4 ) c m , 至大脑前动脉近端, 完全阻断 大脑中动脉起始部的血供, 1 0 m i n 后抽出尼龙线实 现再灌注。 1 . 2 . 2 给药方法: G M - 1 纯标准品由意大利 F I D I A 实验室提供, 用生理盐水稀释后, G M - 1 治疗组于伤 后5 m in 接受1 次G M - 1 ( 3 0 m g / k g ) 腹腔内注射, 以后 每2 4 h 注射 1 次, 直至各时相
14、点处死; 同时, 生理盐 水治疗组接受 1 次等量的生理盐水腹腔内注射; 而 脑缺血再灌注组及正常对照组于伤后未接受任何治 疗。 1 . 2 . 3 标本的制备: 分别于致伤后不同时间点以 4 9 C 4 %的多聚甲醛2 5 0 m 1 经心灌注固定后, 开颅取 脑, 放于相同的外固定液中4 过夜。常规石蜡包 埋, 冠状切片, 片厚l o K m o 1 . 2 . 4 原位细胞凋亡检测( T U N E L 法) : T U N E L 试剂 盒购自德国宝灵曼公司, 试验操作严格按照该公司 提供的说明书进行。 1 . 2 . 5 F a 。 蛋白检测: F a s 免疫组化检测试剂盒购于 北
15、京中山生物技术公司, 实验操作严格按照该公司 提供的说明书进行。每次均做阴性对照, 以P B S 代 替一抗。 1 . 2 . 6 图像分析: 采用G M I A S 一 真彩色医学图像分析 系统( 由北京航天大学提供) 和O L Y M P U S 摄像显微镜 进行海马 C A I 区凋亡阳性细胞记数( 个/ 4 0 ( ) 倍视野) 及 F a , 蛋白阳性细胞的平均光密度值( O D ) 的测定。 1 . 3 统计学分析 实验中所得数据均用 无土: 表示, 经 a c c e s s 数据 库整理后应用美国 S A S统计软件 6 . 1 2 T S 0 2 0 f o r w i n
16、d o w s , 进行方差分析。以双侧 P,0 . 0 5 为差异在 统计学上有显著性意义。 2 结果 2 . 1 原位细胞凋亡检测 脑缺血再灌注组大鼠伤后 1 2 h , 海马 C A I 区即 出现少量凋亡阳性细胞; 伤后 2 4 h阳性细胞数量逐 渐增多; 于伤后 2 一 3 天达高峰; 伤后 1 4 天凋亡阳性 细胞数量有所下降。G M - 1 治疗组伤后凋亡高峰明 显下调, 生理盐水组与脑缺血再灌注组各时相点无 明显差异。正常对照组海马 C A I 区未见凋亡阳性 细胞( 表 1 ) 0 表 I 各组海马 C A I 区神经细胞凋亡( 个/ 4 0 0 倍视野) 时相 分组 时相
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