ES细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究.pdf
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1、E S 细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究 张允平1 2 ,王英杰1 ,张世昌1 ,刘涛1 1 第三军医大学西南医院全军感染痛研究所。重庆4 0 3 8 ;2 上海市第六人民医院 6 2 9 论著干细胞 【摘要】目的探索用生物材料三维培养胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e u ,E s 细胞) 并向肝细胞分化的可行性。方法胰酶消化 悬滴法形成5d 的鼠拟胚胎,将l 1 0 6 m L 鼠E s 细胞与细胞外基质M a t r i g e l “l :l 混合接种于聚乳酸( p o l y L 1 a c t i ca c i d ,P L L A ) 和 聚
2、乙醇酸( p o l y g l y c o l i ca c i d ,P G A ) 共聚合三维支架内,用D M S O 、地塞米松、H G F 、F G F 4 、胰岛素等诱导E s 细胞向肝细胞分化,动态观 察E s 细胞的培育和生长情况,并用R T P C R 、免疫荧光染色检测其肝细胞标志物白蛋白( A L B ) 和甲胎蛋白( A F P ) 的表达。结果 立体显微镜见E s 细胞及分化细胞在聚合支架材料上呈三维立体状态生长,并保持细胞活力。随培养时间延长不断增殖。R T - P C R 检出分化细胞表达A L Bm R N A 和A F Pm R N A 。同样免疫荧光染色也证
3、实表达A L B 和A F P 。结论E s 细胞可在生物材料聚合三维 可降解支架及M a t r i g e l “上生长,并在诱导剂的作用下向肝细胞分化。 【关键词】胚胎干细胞;肝细胞;细胞分化;生物材料 中图分类号:Q 8 1 3 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 6 5 7 0 9 ( 2 0 0 8 ) 0 8 一0 6 2 9 一0 3 收稿日期:2 0 0 8 旬2 - 1 6 T h r e e d i m e n s i o n a lc u l t u r ea n dd i f f b r e n t i a t i o no fe m b r y o n i cs
4、t e mc e U si n t oh e p a t o c y t e s Z H A N GY u n p i n g k 2 ,W A N CY i n g j i e ,Z H A N GS h i c h a n 9 1 ,L I UT a 0 1 1 I n s t i t u t eo fI n f e c t i o u sD i s e a s e ,S o u t h w e s tH o s p i t a l ,T h i r dM i l i t a r yM e d i c a lU n i V e 玛i t y ,C h o n g q i n g4 0 0
5、0 3 8 ;2 S h a n g h a iS i x t hP e o p l e sH o s p i t a l ,C h i n a 【A b s t r a c t 】O b j e c t i V eT oi n v e s t i g a t et h ep o s s i b i l i t yo ft h et h r e e - d i m e n s i o n a lc u l t u r ea n dd i f 玷r e n t i a t i o no fe m b r ) ,o n i c s t e mc e U s ( E S c ) i n t oh e
6、 p a t o c y t e so nb i o m a t e r i a l s M e t h o d sM o u s eE S cw e r er e s u s p e n d e da tac o n c e n t r a t i o no fl l0 6c e l l sp e r1m Lo fc u l t u r em e d i u ma n dm i x e dw i t hM a t r i g e l T Ma tl :1 T h em i x t u r ew e r e8 e e d e di n t op o l y L 1 a c t i ca c i
7、 d a n dp 0 1 y g l y c o l i ca c i dc o p o l y m e r i z e ds c a 丑0 1 d sa n dc u l t u r e di nd i 饪每r e n t i a t i o nm e d j u mc o n t a i n i n gD M S 0 ,d e x a m e t h a s o n e , h e p a t i cg r o w t hf a c t o r ( H G F ) ,f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ( F G F ) 4a n di n
8、 s u l i n ,e ta 1 E S cg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o no nt h e t h r e e - d i m e n s i o n a lb i o d e g r a d a b l ep 0 1 y m e rs c a f f o l dw e r eo b s e n ,e db ys t e r e o m i c m s c o p e T h e e x p r e s s i o n so fh e p a t o c y t e m a r k e r s ,a l b u m i n ( A L B
9、 ) a n dd - f e t o p m t e i n ( A F P ) w e r ee x a m i n e du s i n gR T - P C Ra n di m m u n o n u o r e s c e n c e R e s n l t s S t e r e o m i c r o s c o p ys h o w e dt h a tm o u s eE S co rE Sc e l l - d e r i v e dc e l l sw e r ea t t a c h e dt ot h ec o p o l y m e rs c a f f o l d
10、 sa n dg r e w a c t i V e l yi nat h r e e d i m e n s i o n a l C e l l si n c r e a s e di nq u a n t i t ya n dd e n s i t ya st i m eg o e so n T h eA L Ba n dA F Pm R N A sw e 阳 d e t e 咖i n e di nd i f k r e n t i a t i n gE S ca td a y7a n d1 4b yR T - P C R C o n t r o lg m u pw i t h o u t
11、i n d u c t o rd i dn o te x p r e s sA L B ,b u t m R N A e x p r e s s i o no fA F Pw a ss e e na td a y1 4 I m m u n o c y t o c h e m i s t r ys t a i n i n gr e v e a l e dt h a tt h ed i f & r e n t i a t i n gE S cw e r e p o s i t i v ef b rA L Ba n dA F P C o n c l u s i o n E Sc e U scanb
12、ec u l t u r e da n dd i f 亿r e n t i a t e di n t oh e p a t o c y t e sw i t hM a t r i g e l T Ma n d i n d u c t o r so nt h r e e d i m e n s i o n a lb i o d e g r a d a b l ep o l y m e rs c a f b l d 【K e yw o r d s 】E m b r y o n i cs t e mc e l l s ;H e p a t o c y t e s ;c e l ld i 蜀f e r
13、 e n t i a t i o n ;B i o m a t e r i a l s 自1 9 9 8 年T h o m s o n 等从内细胞团分离到人胚胎 干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l ,E S 细胞) 以来,干细胞成 为生命科学最热门的研究课题。随着有关研究的不断 深入,E S 细胞所具有的能够向不同组织细胞分化的特 性,使之也成为组织工程领域的研究热点,以E s 细胞 为种子、生物材料为载体的骨、软骨、血管、神经等组织 的研究已取得不同程度的进展引。然而,有关E S 细 胞在三维生物材料上的生长与向肝细胞分化的研究为 数尚少,鉴于肝组织工程
14、研究有可能为肝功能衰竭的 治疗提供新的有效措施,本文对E s 细胞在聚合三维 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 3 0 6 7 0 5 2 6 ) 通讯作者:王英杰,E m a i l :y i n g j i e w n g y a h o o c o 。 可降解支架上培养和肝细胞分化进行了初步研究。 l 材料与方法 1 1 材料聚合三维支架材料为非编织型可降解聚 乳酸( p o l y L l a c t i ca c i d ,P L L A ) 和聚乙醇酸( p o l y g l y c o l i ca c i d ,P G A ) 共聚物( 美国S y n t h e c o
15、 n 公司) ,P L L A 和P G A 的聚合比例各5 0 。使用时将支架剪成约5 m m 4 5m m 1m m 的小片,置7 5 的乙醇溶液中浸 泡1h ,P B S 清洗3 次备用。 1 2 E S 细胞培养及胚胎体的形成鼠E S 细胞C C E 株购自加拿大S t e m c e l lT e c h n o l o g i e s 公司,未分化的 E s 细胞维持于含O 1m m o L L 非必需氨基酸、2m m o l LL 谷酰胺、O 1m m o l L 二羟基丙硫醇、1 5 胎牛血 万方数据 6 3 0 清、l0 0 0U m LU F ( r e c o m b i
16、 n a n tm o u s el e u k e m i ai n h i b - i t o r yf a c t o r ,C h e m i c o nI n t e m a t i o n a l 公司) 的I M D M ( I s c o v e sm o d i f i e dD u l b e c c om e d i u m ) 培养液和被覆明 胶的培养瓶内。采用“悬滴法”使E S 细胞在不含L I F 的上述I M D M 培养液中形成胚胎体,5d 后胰酶消化胚 胎体细胞备用。 1 3 E S 细胞的三维支架培养和肝细胞分化调整细 胞数为l 1 0 6 m L ,冰浴下
17、按l :1 比例与M a t r i g e l l 。 ( B DB i o s c i e n c e s 公司) 混合,并快速接种于三维支架 内H ,3 7 下凝固3 0m i n 后移至1 2 孔培养板,诱导分 化组用主要含l D M S O 、l 1 0 m o l L 地塞米松、2 0 n g m LH G F ( r e c o m b i n a n tm o u s eh e p a t i cg r o w t hf a c t o r , R & DS y s t e m s 公司) 、1 0n g m LF G F 4 ( f i b r o b l a s tg m
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