HCV NS5AB片段的表达及在酶活性研究中的应用.pdf
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1、论著文章编号: !“# $%# ;.?6784/ .6 !A.BB39C.D:8DE 7 G7;/ .6 *+,-.+./012 13 +,415602.2/ 78(9 3:;012 -+1/,02 .; /:!“ #$%# %? )= 5A B6-.! ,“ 012% B*,3 -./! %? )= 78 0$ 进行。载体 C$; D; C;E00) , 设计:F端有一互补区、 F端分别含有 !“# ( 和 !$% ( 序列的一对引物,用 *B2 直接进行基因合成。引物 序列为:G:1B BHB1?1 11H 11H 11? HBH 1BB 1?B ?B1 1? 1?H 1HB 1H1 H1
2、B H1B HB? ?H1;2:1B HBH?1? ?BB HBB ?BB ?BH H1H BB? 11H ?H? ?1? B?H H1? 1B? 1B? B?B (均由北京三博远志生物技术公司合成) 。为了使 89? # 多肽片段的结构能在表达的融合蛋白中得到充分展示,分 别在 8端和 B端各加入了一个 1119和9111 连接臂。这 样最终重组在表达载体上的 89?# 基因片段和和表达的氨 基酸序列应为:FBHB1?1 (!“# ()11H 11H 11? HBH 1BB 1?B ?B1 1? 1?H 1HB 1H1 H1B= = H1B HB? ?H1 HBH H?H ?BB H11 ?
3、B? ?1H 11H 11? 11H HBH ?B? (!$% () :F。氨 基酸序列:1119?IHJIB= = B9K9LHMH9111 ( “ = = ” 为酶切 位点) 。 $! ;! ;?# 融合片段的表达和纯化?# 的 “#$%$ 工程菌,在含氨苄青霉素 (% -/= )) 的 )# 培养基中 :EN培养至对数期 ((O%P%! ) ,C;N热诱导 表达过夜。取 $ -) 表达培养液进行 9I9*?1J,观察目的蛋 白表达情况。大量目的蛋白纯化过程,参见文献 ; 。用 ),Q+R 法测定蛋白浓度。 $! ;! :?# 的催化活性。 $! ;! C?# 片段催化活性的测定?# 溶液
4、中,加入一定量的 89: 蛋白酶溶液, 然后用 % -,A= ) *# 缓冲液补充到 $% !),:EN 孵育。经过一定时间催化反应后,取反应液加入 $=: 体积的 9I9*?1J 样品处理液,加热处理后,取 $% !) 进行电泳。电 泳胶进行考马斯亮兰染色,另一胶电转到 *IG 膜后进行 M.47.+5 TA,7 测定。*IG 膜用 % /= ) 脱脂奶粉封闭后,*#9H $U % 稀释的 “2* 标记抗 ()$82 抗体结合 *IG 膜,室温 $ V,*#9H 洗 次,用含 JB) 的 ? 液 # 液 (C%U $) 混合后显色 并在暗室曝光,显影定影。 J)(9? 测定 89?# 活性时
5、,用 $% -/= ) 的抗 ()$82 的 (/1 包被 WO 孔板, $% -)= ) 的牛血清封闭后,加入 % !) 的 催化反应液, :EN结合 $ V,*#9H 清洗后,分别加 $U % 的 “34 -?T 和 $U % “2* 标记的抗鼠二抗,:EN反应 C% -35, *#9H 清洗,HK# 显色,测 (C%值。 #“ 结果 #$ !“%。 #$0“ +,-./%O, ; ($) !“# #$! $“ #“! $#! “$! $“# !$ “#$ !$# $“$ $# #!$ “$! $!# $! ! !#$ “# #“#% ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ;
6、 ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; #“# “#$ “#$ “$! !“# “$“ “!“ !$ “# !$! !#“ #“ #! #“ “$“ !#! #!# $#! “:% ; ; ; ; ;$ )$+3“? 图 1; A)9,2B -+=!CA 载体测序结果和编码蛋白 8DE 1 ;.-! FGHIGJKG ?L 9,C2B -+=!CA LIFD?J EGJG MJN DF NGNIKGN MODJ? MKDN FGHIGJKG ( “$” NGJ?
7、GF -+: KPGMQMEG FDG) 图 :; -+=!CA 融合蛋白纯化的 +.+C(!#4 鉴定 8DE :; +.+C(!#4 ?L IRDLDGN -+=!CA LIFD?J R?GDJ 2:,?S O?PGKIPMR SGDET R?GDJ OMRUGR; 1:“?MP KGPP PVFMG; ::9JKPIFD?J W?NV; 6:(IRDLDGN R?GDJX !“ #$ % 9,2CM 表达纯化结果的 +.+C(!#4 8DE 6; +.+C(!#4 ?L IRDLDGN 9,2C-* 2:,?S O?PGKIPMR SGDET R?GDJ OMRUGR; 1:“?MP K
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