G蛋白偶联受体激酶5在稳定表达α-SYNUCLEIN的SHSY5Y细胞中的基因表达调控功能.pdf
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1、2 0 1 0 年2 月 中国比较医学杂志F e b r u a r y ,2 0 1 0 第2 0 卷第2 期C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E V 0 1 2 0N o 2 G 蛋白偶联受体激酶5 在稳定表达仪S y n u c l e i n 的 S H S Y 5 Y 细胞中的基因表达调控功能 刘鹏,王晓映,高宁,朱华,代小伟,黄澜,徐艳峰,马春梅,秦 川 ( 中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京1 0 0 0 2 1 ) 【摘要】目的
2、 观测G 蛋白偶联受体激酶5 ( Gp r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o rk i n a s e ,G R K S ) 在稳定表达h 瑾一 s y n u c l e i n ( 人突触核蛋白) 的S H S Y 5 Y 细胞的胞核、胞浆中的表达情况并对其在帕金森病中的可能作用进行研究。 方法应用W e s t e r nb l o t t i n g 、组蛋白去乙酰化酶( h i s t o n ed e a c e t y l a s e ,H D A C ) 活性检测技术以及s h R N A 干扰技术等 对稳定表达h a - s y n u
3、 c l e i n 的S H S Y 5 Y 细胞中G R K 5 的表达及其亚细胞分布、胞核内G R K S 蛋白的功能进行研究。结 果发现G R K S 蛋白在过表达h a s y n u c l e i n 的细胞核以及细胞浆内均表达增加,胞核中的G R K S 蛋白通过影响组 蛋白去乙酰化酶的活性对b c l - 2 基因的转录和表达进行调控。结论 帕金森模型中G R K 5 通过对b c l - 2 基因的表达 进行调控发挥作用。 【关键词】G 蛋白偶联受体激酶5 ;帕金森病;d S y n u c l e i n 【中图分类号】R - 3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7
4、 1 - 7 8 5 6 ( 2 0 1 0J 0 2 - 0 0 0 6 - 0 6 F u n c t i o no fG P r o t e i n C o u p l e dR e c e p t o rK i n a s e5 i nh e t - S y n u c l e i nO V e r e x p r e s s i n gS H S Y SYC e l l s L I UP e n g ,W A N GX i a o - y i n g 。G A ON i n g ,Z H UH u a ,D A IX i a o w e i ,H U A N GL a n ,X UY
5、 a n f e n g ,M AC h u n - m e i ,Q I NC h u a n ( K e yL a b o r a t o r yo fH u m a nD i s e a s e sC o m p a r a t i v eM e d i c i n e ,M i n i s t r yo fH e a l t h ;I n s t i t u t eo fL a b o r a t o r yA n i m a lS c i e n c e , C h i n e s eA c a d e m yo fM e d i c a lS c i e n c e s ( C A
6、 M S ) C o m p a r a t i v eM e d i c i n eC e n t r e , P e k i n gU n i o nM e d i c a lC o l l e g e ,B e i j i n g1 0 0 0 2 1 ,C h i n a ) 【A b s t r a c t l0 b j e c t i v eT oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o nl e v e l so fG R K Si nh a s y n u c l e i no v e r e x p r e s s i n gS
7、H S Y 5 Yc e l l s a n dt oe l a r i f yi t sr o l ei nP a r k i n s o n sd i s e a s e M e t h o d sT h ep r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l so fG R K 5i nh 氆- s y n u c l e i n o v e r e x p r e s s i n gc e l l sw e T em e a s u r e db yW e s t e r nb l o t t i n g W e s t e r nb l o t t i
8、n g H D A Ca s s a ya n dR N A it e c h n i q u e sw e r eu s e dt o d e t e c tt h ef u n c t i o no fG R K Si nc y t o s o la n di nn u c l e i R e m i t s B o t ht h ee x p r e s s i o nl e v e l so fG R K So fc y t o p l a s t o i ca n d n u c l e a rd i s t r i b u t i o ns h o w e da ni n c r
9、e a s e :n d u c e db yh a s y n u c l e i no v e r e x p r e s s i o ni nv i t r o N u c l e a ra c c u m u l a t i o no fG R K S i n h i b i t sb k - 2t r a n s c r i p t i o na n de x p r e s s i o n C o n c l u s i o n s G p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r k i n a s e5i s u p r e g u l
10、a t e d i n P a r k i n s o n ed i s e a s e I tp h y sar o l ev i ar e g u l a t i n gt h eb c t - 2e x p r e s s i o ni nt h ep a t h o g e n e s i so fP a r k i n s o n sd i s e a s e 【K e yw o r d s 】a s y n u c l e i n ;G R K 5 ;P a r k i n s o n 8d i s e a s e G R K s ( Gp r o t e i n c o u p
11、l e dr e c e p t o rk i n a s e s ) 是G 蛋白偶联受体激酶,属于丝氨酸酪氨酸蛋白激酶 家族。目前发现G R K s 的主要功能是对G 蛋白偶联 受体( Gp r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r ,G P C R s ) 进行磷酸 【基金项目】8 6 3 项目:2 0 0 6 A A 0 2 A 1 1 5 和2 0 0 4 A A 2 1 5 2 6 2 。 【作者简介】刘鹏( 1 9 8 0 一) 女,博士研究生,研究方向:神经退行性疾病。 【通讯作者 秦川,女,教授。博士生导师。电话:6 7 7 7 9 9
12、1 5 ,E - m a i l :q i n c h u a n p u m c e d u C O 。 万方数据 中国比较医学杂志2 0 1 0 年2 月第2 0 卷第2 期C h i nJC o m pM e d ,F e b r u a r y2 0 1 0 ,V 0 1 2 0 N o 2 7 化,从而介导G P C R 的脱敏反应u 2o 。最近研究发 现G R K s 除了具有通过G P C R 发挥G 蛋白偶联受体 激酶的作用外,还可以通过磷酸化一些非受体底物 发挥作用。G R K 5 是G R K s 家族中的一员,具有所 有G R K 成员的共同特点,其中包括它既可以磷酸化
13、 G P C R s ,也可以磷酸化一些非受体底物,如 t u b u l i n ,s y n u c l e i n s Ho 和核蛋白体P 2 蛋白口1 等。 目前根据G R K 5 的分布和功能确定出了一些结构和 功能域:N - 末端磷脂酰环己六醇4 ,5 一二磷酸( P I P 2 ) 结合域,磷脂结合域( 氨基酸残基5 5 2 5 6 2 ) ,自体 抑制结构域( 氨基酸残基5 6 3 5 9 0 ) ,两个钙调蛋 白( C a M ) 结合域( N 末端氨基酸残基2 0 一3 9 和C 末 端氨基酸残基5 4 0 5 7 8 ) 以及一个D N A 结合细胞核 定位序列( D N
14、 A b i n d i n g n u c l e a rl o c a l i z a t i o n s e q u e n c e ,N L S ) ( 氨基酸残基3 8 8 3 9 5 ) 旧。o 。 A r a w a k a 等训通过对散发性帕金森病人脑组织 进行免疫组化染色发现,路易小体中存在有G R K 5 蛋白和O t s y n u c l e i n 蛋白,同时发现G R K 5 具有磷酸 化a s y n u c l e i n1 2 9 位点丝氨酸的功能,而a - s y n u c l e i n 的这种磷酸化修饰作用可能是其对多巴胺 神经元具有毒性作用的基础。这
15、一发现揭示了 G R K 5 在帕金森病可能具有致病作用。紧接着 B y c h k o v 等川发现G R K 5 的m R N A 水平和蛋白水平 在帕金森痴呆病人中表达均升高。由于G R K 5 参与 了G P C R s 介导的多种细胞信号通路的传导,因此 G R K 5 的表达变化可能会导致帕金森病中信号传导 通路紊乱,从而导致疾病的发生。 本课题组前期的研究发现帕金森病a s y n u c l e i n 转基因小鼠模型具有更高表达水平的G R K 5 【l 引,在 本文中我们对稳定表达h a - s y n u c l e i n 的S H S Y 5 Y 细 胞系进行G R
16、K 5 蛋白表达变化的研究,并对其亚细 胞水平的表达变化进行观察。G R K 5 的D N A 结合 细胞核定位序列的发现一o ,使人们对G R I O 在细胞 核内是否具有调控功能产生了研究兴趣。2 0 0 0 年, E c k h a r t 等人驯发现G R K 5 对一些基因的表达具有 调控作用。2 0 0 8 年M a r t i n i 等人4 。又发现了G R K 5 除了通过其经典的磷酸化G P C R 的功能外,还可以 作为H D A C 激酶实现对核内基因的调控作用,从而 参与心肌肥大疾病的发生。同年S o r r i e n t o 等纠发 现G R K 5 通过增加细胞
17、核内I g B c t ,进而抑制N F K B 的转录活性。基于以上报道,本文在确定帕金森病 模型中G R K 5 蛋白表达分布变化的基础上对其核内 相关功能进行了进一步的研究。 l 材料与方法 1 1 试剂和抗体 R i p a 蛋白裂解液( 碧云天公司) ,T f i z o l 试剂 ( I n v i t r o g e n ) , R e v e r t A i d 佃F i r s tS t r a n dc D N A S y n t h e s i sK i t ( F e r m e n t a s 公司) ,R e a h i m e P C RM a s t e r M
18、 i x ( S Y B RG r e e n ) ( T o y o b o 公司) ,B C A 蛋白定量试 剂盒( P i e r c e 公司) ,硝酸纤维素膜( M i l l i p o r e 公司) , 丙烯酰胺、N ,N :亚甲基甲叉双丙烯酰胺和T E M E D 均购自北京鼎国生物公司,所有引物均由上海生工 生物公司合成。G R K 5 抗体( S a n t aC r u z 公司) ,仅 s y n u c l e i n 抗体( A b c a m 公司) ,B c l - 2 抗体( A b c a m 公 司) ,H R P 标记的G A P D H 抗体( 上海
19、康成生物公 司) ,羊抗兔、羊抗鼠I g G H R P 购自北京中杉金桥生 物公司。L i p o f e c t i n T M 2 0 0 0t r a n s f e c t i o nK i t ( I n v i t r o g e n 公司) ,N E - P E RN u c l e a ra n dC y t o p l a s m i c E x t r a c t i o nR e a g e n t s ( P i e r c e 公司) ,干扰G R K 5 的 s h R N A ( O p e nB i o s y s t e m s 公司) ,H D A CA
20、s s a y K i t ( c o l o r i m e t r i cd e t e c t i o n ) ( U p s t a t e 公司) o 1 2 稳定表达h a - s y n u c l e i n 的S H S Y 5 Y 细胞系的 建立 神经母细胞瘤细胞S H S Y 5 Y 购自中国医学科学 院细胞中心,稳定表达h a s y n u c l e i n 的S H S Y 5 Y 细 胞系由本课题组建立“。 1 3S h R N A 干扰 对转染用s h R N A 质粒进行提取,将所提取质粒 的测序结果与O p e nB i o s y s t e m s 公
21、司给出的s h R N A 核苷酸序列进行比较,序列正确的质粒进行细胞转 染,转染后7 2h 提取细胞总R N A 和总蛋白。用 r e a l t i m eP C R 和W e s t e r nb l o t t i n g 对目标基因进行检 测。根据得到的实验结果,我们从5 种s h R N A 中选 择了抑制G R K 5 表达效果较好的2 种s h R N A 进行 了后续相应的实验。序列为: s h R N A l G R K 5 :5 C C G G A C G A G A T C A T A G A A A C A G A A T C T C G A G A T T C T
22、G T I T C T A T C A T C T C G T l - r I 1 1 3 : s h R N A 2 G R K 5 :5 C C G G C C A C C A C A T A A A C T C A A A C C A C T C G A G T G G l 兀G A G T r T A T G T G G T G G T I m 3 。 1 4 蛋白提取以及W e s t e r nB l o t t i n g 离心收集细胞,加入含P M S F 蛋白裂解液。冰上 充分裂解后4 。C1 40 0 0r m i n 离心2 0m i n 。提取上清 液于即为总蛋白。利用
23、N E P E Ron u c l e a ra n d 万方数据 8 中国比较医学杂志2 0 1 0 年2 月第2 0 卷第2 期C h i nJC o m pM e d F e b r u a r y2 0 1 0 。V 0 1 2 0 N o 2 c y t o p l a s m i ce x t r a c t i o nr e a g e n t s ( 胞浆胞核蛋白提取试 剂) 进行胞核和胞浆蛋白的提取,具体步骤参见说明。 B C A 试剂盒进行蛋白定量后,取等量样本蛋白,加入 S D S 上样缓冲液,混匀后沸水中变性,1 0 S D S P A G E 电泳分离,电转移至硝酸纤
24、维素膜,含5 脱 脂奶粉的T B S T 缓冲液封闭,抗体4 过夜杂交。次 日T B S T 洗膜,辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育 l h ,T B S T 洗膜,E C L 显影定影显现信号。H R P 标记 的G A P D H 抗体作为总蛋白内参。q t u h u l i n 以及 P C N A 分别作为胞浆蛋白和胞核蛋白内参。 1 5R N A 提取以及R e a l - t i m eP C R T r i z o l 法常规提取R N A ,经D N A 酶处理后,逆 转录为e D N A ,采用实时定量聚合酶链反应( r e a l t i m eP C R ) 进行检测。
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- 关 键 词:
- 蛋白 受体 激酶 稳定 表达 SYNUCLEIN SHSY5Y 细胞 中的 基因 调控 功能
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