GRAVES病动物模型研究进展.pdf
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1、陕西医学杂志2 0 0 6 年 3 月第 3 5 卷第 3 期 3 21 综述与讲座 G r a v e s 病动物模型研究进展 西安交通大学第一医院内分泌科( 西安7 1 0 0 6 1 ) 武敏综述施秉银审校 G r a v e s 病( G r a v e s d is e a s e , G D ) 是一种以甲 状腺功能 亢 进 为 主 征 的 器 官 特 异 性 自 身 免 疫 性 疾 病 。 在 环 境 与 遗 传因素的相互作用下, 机体免疫系统产生了针对促甲状 腺激 素 受体 ( T h y r o t r o p in r e c e p t o r , TH S R)的抗 体
2、 ( T RA b ) 。 其中, 刺激性抗休( TS Ab ) 可模拟TS H功能, 导 致甲状腺激素过度分泌。9 0 %以上初诊 G r a v e s 患者血清 中存在T S Ab t 1 , 标准化、 符合临床实际的GD动物模型, 有助于研究T S A b产生的免疫机制。早期的研究者们做 了诸多的探索, 如免疫可溶性TS H R抗原肚、 肌注 T S HR 裸c D NA、 甲状腺组织异体移植、 原核细胞重组 T S H R多 胶 等 。 上 述 方 法 存 在 的 共 同 问题 , 为 无 法 维 持 T S H R 抗 体 滴度、 不能激发和保持TS HR在动物体内的生物活性, 距
3、 离理想的GD动物模型仍有差距。 本文对此领域近年来的 研 究 进 展 加 以综 述 . 1表达TS H R的M1 2细胞或HE K - 2 9 3 细胞免痰 B AL B / c 小 民 1 9 9 9 年, K a it h a ma n a等 e1 构建T表达 T S H R全长的 M1 2细胞系及表达 T S HR胞外段( # T S HR) 的】 I E K - 2 9 3 细胞. 选取 6 -8 周龄遗传背景为H- 2 “ 的雌性B AL B / 。 小 鼠, 腹腔注射 1 . 2 X1 0 M1 2细胞, 对部分试验动物加用了 Th , 佐剂一 霍乱毒家B亚单位( C T B)
4、。 经过9 0 -1 8 0 d饲养 或 观 察 发 现 , M 1 2 细 胞 十CT B 和 H E K- 2 9 3细 胞 十C TB 组 1 0 0 %的小鼠发展成为甲亢, E L E S A法检测到血清 T S Ab , T B I I 水平不同程度升高. 除此之外, 试验者还用纯 化的 E T S HR蛋白+C T B免疫小鼠 获得了与前两组同 样的效果。与对照组相比, 甲亢鼠出现体重下降, 甲状腺 体积增大, 淋巴细胞浸润。 据此, 他们认为: T M1 2 细胞是 一种B细胞, 具有抗原呈递细胞的特性, 能表达 MHC - I 分子和B 7 , 与早些研究中使用的AKR / N
5、小鼠相比, 本 试验中的B A L B / c ( H- 2 ) 小鼠对G D更加易感。 在免皮 反 应 中 B AL B / c 小 鼠 产 生 以 C D4 十 T 细 胞 为 主 的 T h : 应 答, 丁 h : 细胞可促进机体产生高亲和性抗体诱导动物 摸型的关键在于, 免疫用的工程细胞在动物体内能够表 达结构完整的E T S H R, Do g a n 为了研究I L - 4和I NF - Y 在 G D 发 展 中 的 作 用 , 也 采 用 M 1 2细 胞 +C TB方 法 , 分 别免疫I L - 4 - / 一和 I N F - Y -/ -B AL B / c小鼠结果显
6、 示, I L - 4 -/ 一组甲亢发生率较低, 而I N F - Y -/ 一组与对 照 组 无 差 别 。 因此 , 作 者 认 为 I L - 4在 GD 的 发 生 、 发 展 中 哥国家自然科学荃金项目( 3 0 3 7 1 3 3 5 ) 是必不可少的。 2联合表达 T S H R和 MH C- I 类分子的成纤维母 细胞免佼小跳 在这种建立 G D摸型的方法中, S h imo j o等1“ , 挑选了 RT 4 . 1 5 H P作为载体细胞.R T4 . 1 5 H P细胞属于鼠的成 纤维母细胞, 具有表达含A户和A 爵的MH C - I类分子杂 合 基 因 的 特 性 。
7、 接 着 用 携 带 人 T S H R 基 因 的 真 核 表 达 载 体转染R T 4 . 1 5 HP细胞, 以不含MHC - I类分子的D A P . 3 细胞作为阴性对照 A KR / N( H - 2 t ) 小鼠被腹腔注射1 0 个R T4 . 1 5 H P-T S HR细胞, 每 2周免疫 1次, 共免疫6 次 。 结 果 显 示 , 试 验 组 中 。 约 2 0 环 的 小 鼠 表 现 为 甲 亢 一 甲状 监激素水平升高, TS Ab , T B I I阳性及甲状腺弥慢性肿大, 而对照组无一例发生。作者认为R T4 . 1 5 H P细胞在活体 试验中扮演了抗原呈递细胞
8、的角色。 Kit .在S h imo jo研究 的基础上, 加用了T h和Th , 佐剂 s7 。 在第一组中, A KR / N小鼠被免疫 R T 4 . 1 5 HP 一T S H R细胞和Th e 佐剂组织 毒 素 (Pert-is t o x in P T X) , 第 二 组 腹 腔 注 射 R T4 . 1 5 HP 一T S HR细胞和 T h , 佐剂弗氏佐剂( C o mp l e t e F r e u c d s a d ju v a n t C F A) , 另设无佐剂千扰的对照组。9 周后检侧发 现 P TX组甲亢诱发率近 5 0 %, 远高于对照组 2 5 % 而
9、C F A组仅为 1 0 %; AKR ! N小鼠的性别因素对 G D诱发 无影响, 同时阐述了实用 G D动物模型所应具备的6条标 准。有研究者t ee 也在S h imo j 。研究方法的基础上, 辅以佐 剂明矾十P T X, 结果显示 8 0 %小鼠产生了T B I I , 7 0 %的 血清中出现 T S Ab , 无琳巴细胞浸润的甲状服肿占6 0 %, 而仅有1只发展成为甲亢. 对鼠血清中产生的针对丁 S H R 抗体研究发现 + I , 大部分 鼠血 清中仅存在 TS Ab或 TB Ab , 但有 1 3 %兼有两种抗体. 3编码的真核表达载体免疫小鼠 此方法的基本过程是将TS H
10、R c D N A克隆到某一真 核表达载体中, 将载体注射到动物体内. 通常采用腹腔注 射或肌肉注射方式, 载休感染宿主细胞后, 在宿主细胞表 面表达 c D NA编码 的蛋 白。C o s t a g li o l a “ 用此法免疫 B A L B / c雌性小鼠。1 1 周后发现约 7 0 % ( 1 0 / 1 4只) 小鼠 血清T B I I 和T B Ab水平升高, 役有1只小鼠血清 F T。 水 平 升 高 , 这 种 现 象 持 续 了 了周 左 右 。 光 镜 下 , 试 验 组 小 鼠 甲状腺呈现严重的淋巴细胞浸润。这些数据表明, 试验小 鼠只产生了甲状腺炎。随后研究者们
11、又选用远交 系 N MR I 小鼠E , l肌注工程载体.2 9 只雌鼠中有5只、 3 0 只 雄 鼠 中 有 1只 表 现 出 总 T 。 水 平 升 高 , TS H 受 抑 , 伴 有 甲 3 22陕西 医学杂志 2 0 0 6年 3月第 3 5卷第 3期 状腺肿大及淋巴细胞浸润。虽然上述研究中约1 7 %的远 交系 N MR I 小鼠出现甲亢症状, 但 P ic h u r in “ - 用此法 免 疫 近 交 系 B A L B / o 小 鼠 和 A KR/ N 小 鼠 却 没 有 成 功 。 T S HR 抗 体 水 平 很 低 几 乎 探 侧 不 到 , 然 而 在 B AL
12、B / e 小 鼠的脾脏中发现, T h l 型细胞因子 I N F - Y和I L - 2的激增。 在上述研究基础上. B a r r e t t采用皮下注射免疫近交系 B AL B / e小鼠, 6 7 %出现了针对T S H R的自身抗体G z j 。 在 对高加索人群的研究中发现, HL A - DR B I “ 0 3 0 1 ( D R 3 ) 等 位基因是G r a v e s 病发生发展中的 易感基因。F l y n n “ 7 以 携带DR 3易感基因的 N OD小鼠为实验对象, 肌注含人 TS H R全长的工程载体, 并联合注射I L - 4 或GM- C S F。 约 2
13、 0 %的小鼠产生T S Ab , T 水平升高者占2 5 纬, 约3 0 %出 现了不同程度的甲亢症状。P a v e l “ 利用TS HR D NA免 疫 T S HR基因敲除C 5 7 B L / 6 / 1 2 9 小鼠, 免疫结果与野生 型小鼠相似.有学者发现“ . B AL B / c 小鼠皮下注射编码 T S H R真核表达载体后, 6 7 %产生T S A b , 2 7 %血清 T T, 水平升高. 而联合表达I L - 4或I L- 2的TS HR载体免疫小 鼠后 , 未 出 现 TS Ab和 甲 亢 症 状 . 4表达TS HR的腺病毒免疫小段 近年来, 随着膝病毒载体
14、不断改进完警, 以其装载容 量大、 可在宿主细胞中大量增殖等特点, 被广泛用于科学 研究. N a g a y a , n a 0 aI 等人构建了编码T S H R全长的腺病毒 载体, 肌注 B A L B / c ( H- 2 “ ) , C 5 7 B L / 6 ( H - 2 ) , C B A/ J ( H- 2 ) , D B A/ 1 J ( H - 2 ) 、 和S J L / J ( H- 2 ) 品系的小鼠, 每隔 3 周免疫1次, 共免疫3次。 8周后监测发现, 5 %雌性、 3 3 纬 的雄性B AL B / c 和2 5 雌性C5 7 B L / 6小鼠血清T TS
15、 I , TB I I 水平升高。而在C B A/ J ( H - 2 ) , D B A/ 1 J ( H - 2 ) 、 和 S J L / J ( H- 2 ) 三个品系中, 均未出现甲亢症状, 除 S J L / J ( H - 2 ) 组 T B I I 活性较高外, 其余两组无TS HR抗体产 生。据此, 该学者提出T S I 水平与 T 水平正相关, T。 与 T B I I , TS I 与 TB I I 之 间 无 明 显 数 量 关 系 , B AL B/ c 小 鼠 具 有对GD易感的特性。 在 T h , / T h : 细胞因子的研究中, 有 学者用表达 T S HR
16、的腺病毒和表达工 L - 4或工 L - 1 2的腺病 毒载体联合免疫雌性 B AL B / c小gL v 7 ,结果是T S H R+ I L - 1 2组疾 病发生率 约为 5 3 %, 与 T S HR组相似, 而 T S HR + I L - 4组 仅 为1 3 % 。 在T S HR + I L - 4 组 中 , 抗 T S HR抗体 I g G 2 a : I g G 1 ( T h , : T h , ) 及特异性 I N F - Y 分泌 水 平 均 明 显 低 于 T S H R 组 TS HR+ I L - 1 2组 。 相 反 的 , TS HR + I L - 1 2
17、组 这 两 项 明 显 高 于 对 照 组 。 与 此 同 时 , 包 括 TS H R+I L - 4 组在内的各试验组均无工 L - 4分泌.这些数 据显示T h 型免疫应答在G D动物模型建立中起着重要 作用; 在治疗阶段应着眼于T h , 向T h : 免疫应答的逆转. C h e n C h u n - r o n g “ 通过拢带T S H R - 2 8 9 ( A亚单位) 的膝 病毒免疫雌性 B AL B / c小鼠试验, 证明游离的T S HR A 亚单位能够诱导并增强免疫应答. 导致甲亢的发生。有研 究发现 W 经受氏血吸虫感染或。 一 半乳糖神经酸胺( n - Ga l
18、c e r ) 处 理 后 可 抑 制 小 鼠 T h , 免 疫 反 应 , 减 少 甲 亢 的诱 发 率 。 利 用 拥 带T S HR A 亚 单 位 的 腺 病 毒 载 体 免 疫 C 5 7 B L / 6 , B A L B / c 及其子一代小jxm , 发现B A L B / 。 小 鼠对 甲 亢 易 感 . 5转甚因动物镇型 在 以 上 谈 及 的 各 种 方 法 中 , 虽 然 试 验 小 鼠 出 现 不 同 程度的甲亢表现, 但这种免疫应答是暂时性的, 所产生的 T S A b都是针对外来TS HR。为了克服上述问题, 转基因 方法被用于建立GD动物模型。Ki m - S
19、 a ij o “ 从 G D患者 的外周血里提取表达 T S A b的B细胞克隆- B 6 B 7 , 关于 B 6 B 7 特点已有多位学者在早期报道过( “ - ) . E B病毒转 染 B细胞, 使其永生化后, 从中分离出 T S Ab重链( H) 和 轻链( L) 可变区( V) 的c D NA。经过P C R扩增, 依次连接 5 . 7 Kb的轻链, 3 . 7 Kb含5 非编码区的VD J片段和 4 . 7 K b的重链。 在此片段上游 5 0 0 b p处加人AT G启动密码 子, 同时还包括一些增强子及附件。1 4 . 1 K b的片段微注 射人C5 7 B L / 6 J
20、小鼠的受精卵中, 观侧时间设定在小鼠出 生 后 1 2 - 2 0 周 。结 果 如 下 : 与对 照 组 不 同 , 转 基 因 组 小 鼠 血清 F T。 升高、 T S H水平下降. 伴有基础体温升高、 体重 下降、 吸拱率升高和甲状腺组织增生表现, E L E S A法检 侧血清 Ig M升高, 与 F T。 水平正相关, 但外周血中I g M B 细 胞 总 数 呈 下 降 趋 势 , 考 虑 是 由 自体 反 应 和 克 隆 缺 失 所 致, 值得探讨的是, I g M十B细胞存在腹膜腔聚集现象, 进 一步分析发现, 聚集的I g m十 B细胞中, MA C - 1 - B l细胞
21、 占4 0 %, 其中B l a和B l b数量相当. 参 考 文 献 1 We e t ma n A P . Gr a v e s d i s e a s e . N E n g l J Me d , 2 0 0 0 : 3 4 3 : 1 2 3 6 2 K a i t h a m a n a S, F a n J , Os u g a Y, e t a l . I n d u c t i o n o f e x p e r i m e n t a l a u t o i mmu n e G r a v e s d i s e a s e i n B A L B / c mic e . J
22、 I mmu n o l , 1 9 9 9 ; 1 6 3 : 5 1 5 7 3 D o g a n R N, V a s u C. H o l t e r ma n M J , e t a l . Ab s e n c e o f I L - 4 , a n d n o t s u p p r e s s io n o f t h e Th 2 r e s p o n s e , p r e v e n t s d e v e l o p me n t o f e x p e r i m e n t a l a u t o immu n e G r a v e s d i s e a s
23、 e . J I mmu n o l , 2 0 0 3 ; 1 7 0 : 2 1 9 5 4 S h i m o jo N, Ko h n o Y. Y a ma g u c h i K, e t a l . I n d u c t io n o f Gr a v e s - l i k e d i s e a s e i n mi c e b y immu n i z a t i o n w it h f ib r o b l a s t s t r a n s f e c t e d w i t h t h e t h y r o t r o p in r e c e p t o r
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