HUNTER综合征患者IDS基因的一个新突变.pdf
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1、 临床遗传学研究 Hunter 综合征患者 IDS 基因的一个新突变 郭奕斌林群娣杜传书 【摘要】 目的研究 Hunter 综合征患者的艾杜糖-2-硫酸酯酶 (iduronate-2-sulfatase, IDS) 基因的突变情 况, 为产前基因诊断等打下基础。方法应用尿粘多糖含量检测、 聚合酶链反应-变性高效液相色谱 (poly- merase chain reaction-denaturing high-performance liquid chromatography, PCR-DHPLC) 分析对 1 例 Hunter 综合征患 者及其父母的 IDS 基因的突变热点第 9、 3、 8
2、外显子进行突变检测,并对 PCR-DHPLC 检出的突变样品进行 直接测序。结果经 PCR-DHPLC 分析发现该患者的 IDS 基因第 9 外显子有明显异常峰形; DNA 序列分析 进一步发现该外显子发生一新的移码突变, 突变部位在第 482 位密码子 (TTA) 内, 即 cDNA 第 1569 bp 的 T 后插入了 2 个 T, 致使新肽链提前在第 483 位遇上终止密码 TAA, 导致新肽链从原来的 550 个氨基酸缩短至 482 个。该患儿为这一突变的半合子, 而其母为这一突变的杂合子。结论PCR-DHPLC 和 DNA 序列分析 是诊断 Hunter 综合征的有效方法, 发现的移
3、码突变 (1569 + TT) 导致肽链比正常的少了 68 个氨基酸, 从而引 起 IDS 酶活性明显降低, 可能是该 Hunter 综合征患者的致病原因。 【关键词】 Hunter 综合征; 粘多糖贮积症型; 艾杜糖-2-硫酸酯酶; 基因突变; 变性高效液相 色谱; DNA 序列分析 A new mutation of iduronate-2-sulfatase gene from the patient with Hunter syndrome*GUO Yi-bin,LIN Qun- di,DU Chuan-shu .( Department of Medical Genetics, SU
4、N Yat-sen Medical College, SUN Yat-sen University, Guangzhou,Guangdong,510080 P . R . China . Email: guoyibinmail . sysu . edu . cn) 【Abstract】 ObjectiveTo identify the mutations of iduronate-2-sulfatase(IDS)gene, and to establish a basis of prenatal gene diagnosis of Hunter syndrome. MethodsUrine g
5、lycosaminoglycan (GAG)assay was used to preliminary diagnosis of mucopolysaccharidosis. PCR-denaturing high-performance liquidchromatograptly (PCR-DHPLC)analysis was performed to detect the mutation in exons 9, 3, 8 of the IDS gene. DNA sequencing was applied to analyze the mutation detected by PCR-
6、DHPLC. ResultsAbnormal peaks were found by PCR-DHPLC. A new frame-mutation(1569 + TT ) in exon 9 of IDS gene was identified by DNA sequencing. Two“T”inserted in position 1569 base pair (1569 + TT) caused a substitution of codon 482 (TTA, leucine) to 482 (TTT, phenylalanine) . The“TT”insertion result
7、s in the decrease of amino acids from 550 to 482. The patient is a hemizygote and his mother is a heterozygote. ConclusionA new frame-shift mutation of IDS gene is found to report. The mutation(1569 + TT)results in 68 amino acids lost. Probably it causes the enzyme activity seriously dropped down an
8、d being pathologically the basis of disease. 【Key words】 Hunter syndrome; mucopolysaccharidosis type; iduronate-2-sulfatase; gene mutation; denaturing high-performance liquid chromatography; DNA sequencing *Supported by the China Medical Board of New York (2003) Hunter 综合征 (MIM 309900) 是一种严重致残、 致死性的
9、 X 连锁隐性遗传病,因基因突变导致溶酶体内艾杜糖-2-硫酸酯 酶 (EC 3.1.6.13)缺乏,以致粘多糖在体内大量沉积,尿中大 量排出硫酸皮肤素和硫酸已酰肝素。临床表现多样,症状轻 者智力可以正常,并可存活到成年。而重者则起病早,一般成 年前夭折。本病呈进行性加重,预后甚差, 目前尚无有效治疗 方法, 常用的尿糖胺聚糖类检测只能初诊, 酶测定法也不能完 全准确地鉴定携带者,因此,进行基因诊断和产前诊断是目前 预防该病发生的最有效方法 1。我们对来自广东的 1 个粘多 糖病家庭进行了 IDS 基因的突变检测, 现将结果报告如下。 基金项目: 美国中华医学基金会 (CMB) 部分基金资助项目
10、 (2003) 作者单位: 510080 广州, 中山大学中山医学院医学遗传室 1对象与方法 1.1对象患者, 男, 3 岁半,汉族, 第 1 胎, 足月顺产。1 岁后 出现进行性加重的反应迟滞, 走路不稳, 智力低下, 听力、 视力 正常, 能发单音和简短词语,在我校附一院儿科就诊, 疑是 “粘 多糖病” 而送我室做尿糖胺聚糖类检测, 结果显示: 硫酸皮肤素 ( + + ) , 硫酸乙酰肝素 ( + + ) , 肝素、 硫酸软骨素 ( - ) , 硫酸角 质素 ( - ) 。查体: 身高 1.0 m,体重 15 kg,皮肤粗糙, 毛发浓 密, 凸额, 颈短, 耳大, 腹胀, 双侧腹股沟斜疝,
11、爪形手。根据临 床表现和尿检结果,初步诊断为本病。该患儿出生时父亲 29 岁、 母亲 21 岁, 表型均正常, 非近亲结婚,家族中无类似病史。 1.2方法 1.2.1引物及试剂按文献 2 合成扩增 IDS 基因第 9、 3、 8 外 显子的 3 对 引 物。引 物 序 列 分 别 如 下: IDS9a: 5-ATGTAACC- 76中华医学遗传学杂志 2006 年 2 月第 23 卷第 1 期Chin J Med Genet,February 2006,Vol. 23,No. 1 CATTCTGCTCTG-3,IDS9b:5-GCTGGAAGGGAGCACATC-3; IDS3a: 5-GCT
12、GTTTGCTAGGAGCCTCG-3, IDS3b: 5-CACTTTGGGT- GAAAACGTGGC-3;IDS8a: 5-TCTGTGGTAATTCCAAGTG-3, IDS8b: 5-CCCCCAAAGCCTATGATTC-3。所用试剂除 dNTPs、 Taq DNA聚 合 酶 (GENDA) , 100 bp、 123 bp DNA 标 记 物 (GIBCO/ BRL) , SDS、 蛋白酶 K、 琼脂糖 (Sigma) 外, 其余均为国产分析纯 级。 1.2.2DNA 提取及浓度测定按我室常规方法进行 3。 1.2.3PCR 扩增反应体系为 30L, 含 10 Taq 缓冲液 3
13、 L, 2 mmol/ L dNTPs 3L,上、 下游引物 (10mol/ L) 各 1L, DNA 模 板 1.5L (约 300 ng) , Taq DNA 聚合酶 2.5 U, 加 ddH2O 至 30 L。在 Hema 480 型 PCR 扩增仪 (珠海黑马公司) 上完成 IDS 基 因第 9、 3、 8 外显子的 PCR 扩增, 条件如下: 95预变性 90 s 后, 94变性 40 s,55退火 30 s,72延伸 40 s,完成 35 个循环后 于 72继续延伸 5 min,然后于 4保温。各取 2.5L PCR 产 物用 2% 琼脂糖微型凝胶检测, 扩增片段长度为 554 b
14、p。 1.2.4变性高效液相色谱分析取 5 7L PCR 产物,与等量 的正常标本的 PCR 产物混合,95 变性 10 min 后上样, 用 The WAVE Nucleic Acid Fragment Analysis System D7000 HPLC 分析仪 (TRANSGENOMIC 公司) 进行突变筛检。 1.2.5DNA 序列分析将 DHPLC 检测显示有异常峰形的 PCR 产物交上海博亚公司用 ABI PRISM 3730 型 DNA 序列自动分析 仪 (BIOASIA 博亚公司) 完成双向测序。 2结果 2.1PCR-DHPLC将患儿及其父母 IDS 基因第 9 外显子的 P
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