HIV1 GAG蛋白 P2NC 蛋白酶切割位点序列的随机化及噬菌体展示.pdf
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1、第 二 军 医 大 学 学 报 A c a dJS e c M i l M e d U n i v 2 0 0 5N o v ;2 6(1 1)1 2 4 3 论 著 H I V - 1G a g蛋白P 2 /N C蛋白酶切割位点序列的随机化及噬菌体展示 周 波2, 贾建安1, 温宗梅2, 邓松华2, 蒋少华1, 陈秋莉1, 潘 欣1, 潘 卫1* (1.第二军医大学基础医学部微生物学教研室, 上海2 0 0 4 3 3;2.安徽医科大学病理生理学教研室,合肥2 3 0 0 3 2) 摘要 目的:构建H I V - 1G a gP R蛋白P 2/N C切割位点序列随机化的噬菌体展示文库, 研究
2、H I V - 1蛋白酶( p r o t e a s eP R) 耐药性突变对其敏感切割序列的影响。方法:P C R扩增制备重组H I V - 1g a g基因上的C A P 2和N C片段, 在C A P 2片段5 端引入S t u酶切位点, 3 端P R切割位点处的氨基酸序列进行随机化; 在N C片段5 端设计重叠区域,3 端引入S a l酶切位 点。应用O v e r l a p p i n gP C R将C A P 2和N C片段拼接并克隆于噬菌体展示载体L D 3 - p C AN TA B 5 S上, 建立H I V - 1 P R靶蛋白 C A P 2和N C之间切割位点随机化
3、的噬菌体展示文库。结果:该噬菌体展示文库库容量为2. 11 0 6, 滴度为3. 01 01 2TU/ m l,C A P 2/N C片段插入率为5 2. 1%;1 2个样品的序列分析显示切割位点中随机化的核苷酸与氨基酸均呈随机性分布;1 0个 阳性单克隆噬菌体C A P 2/N C - L D 3 - p C AN TA B 5 S样品中9个与I g G特异结合。结论:成功地对H I V - 1 P R靶蛋白C A P 2和 N C之间切割位点进行了随机化并展示于噬菌体表面, 构建了其噬菌体展示文库, 为筛选耐药性突变的P R敏感切割序列及构 建蛋白酶抑制剂噬菌体筛选模型打下基础。 关键词
4、H I V - 1; 蛋白酶; 切割位点序列; 随机化; 噬菌体展示文库 中图分类号 R3 7 3. 9 文献标识码 A 文章编号 0 2 5 8 - 8 7 9 X(2 0 0 5)1 1 - 1 2 4 3 - 0 5 R a n d o m i z a t i o no fP 2/N Cp r o t e a s ec l e a v a g e s i t eo fH I V - 1G a gp r o t e i na n da n di t sp h a g ed i s p l a y Z HOUB o 2, J I AJ i a n - a n 1,WE NZ o n g -
5、m e i2, D E NGS o n g - h u a 2, J I ANGS h a o - h u a 1, CHE N Q i u - l i 1,P AN X i n1,P AN W e i1* (1. D e p a r t m e n to fM i c r o b i o l o g y,C o l l e g eo fB a s i cM e d i c a l S c i e n c e s,S e c o n dM i l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s i t y,S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3,C h
6、i - n a;2. D e p a r t m e n to fP a t h o l o g ya n dP h y s i o l o g y,A n h u iM e d i c a lU n i v e r s i t y,H e f e i 2 3 0 0 3 2) A B S T R A C T O b j e c t i v e:T oc o n s t r u c t t h ep h a g ed i s p l a yl i b r a r yo fr a n d o m i z e dP 2/N Cp r o t e a s ec l e a v a g es e q
7、u e n c e si nH I V - 1 G a gp r o t e i n,s oa s t op r o v i d ee v i d e n c e sf o rs t u d y i n gt h ee f f e c to fd r u gr e s i s t a n c e - a s s o c i a t e dm u t a t i o n so ns u s c e p t i b l ec l e a v a g e s e q u e n c e so fH I V - 1P R.M e t h o d s:C A P 2 f r a g m e n t s
8、a n dN Cf r a g m e n t so fH I V - 1g a gw e r eg e n e r a t e db yP C R.S t ur e s t r i c t i o n s i t ew a s i n t r o d u c e dt o t h e 5 t e r m i n a l o fC A P 2f r a g m e n t s a n d t h ep r o t e a s e c l e a v a g e s e q u e n c e so f 3 t e r m i n a l o fC A P 2f r a g m e n t s
9、w e r e r a n d o m i z e d . T h eo v e r l a p p i n gC A P 2s e q u e n c ew a s i n t r o d u c e d t o t h e 5 t e r m i n a l o fN Cf r a g m e n t s a n dS a lr e s t r i c t i o ns i t e w a s i n t r o d u c e dt ot h e3 t e r m i n a l . C A P 2a n dN Cf r a g m e n t sw e r e l i n k e db
10、 yo v e r l a p p i n gP C Rm e t h o da n dt h ef u s e dC A P 2a n d N Cf r a g m e n t sw e r ec l o n e d i n t op C AN TA B 5 S - L D 3t oc o n s t r u c t t h ep h a g ed i s p l a yl i b r a r yo f t h eP 2/N Cc l e a v a g es i t e i nH I V - 1 G a gp r o t e i n . R e s u l t s:A sm u c ha
11、s 2. 11 0 6c l o n e sw e r eo b t a i n e d i n t h ep h a g e l i b r a r ya n d t h e t i t e rw a s 3. 01 01 2TU/ m l . T h e r e w e r e5 2. 1%c l o n e sc o n t a i n i n g i n s e r t e dC A P 2/N Cf r a g m e n t s . S e q u e n c e a n a l y s i so f 1 2s a m p l e s s h o w e d t h a t n u
12、 c l e o t i d e a c i d s a n d a m i n oa c i d sw e r er a n d o m l yd i s t r i b u t e da tr a n d o m i z e dP Rc l e a v a g es i t e s .N i n eo f1 0p o s i t i v em o n o c l o n a lp h a g e ss p e c i f i c a l l y b o u n dt oh u m a n I g G. C o n c l u s i o n:C A P 2/N Cp r o t e a s
13、 e c l e a v a g e s e q u e n c e so fH I V - 1G a gp r o t e i nh a v eb e e ns u c c e s s f u l l yr a n d o m - i z e da n d i t sp h a g ed i s p l a y l i b r a r yh a sb e e nc o n s t r u c t e d,w h i c hm a yh e l pt os c r e e nt h ep h a g e s c o n t a i n i n gs u s c e p t i b l e c
14、l e a v a g e s e - q u e n c e so fP Rw i t hd r u gr e s i s t a n c e - a s s o c i a t e dm u t a t i o n sa n de s t a b l i s ht h ep h a g em o d e l f o ri nv i t r os c r e e n i n go fP Ri n h i b i t o r . K E Y WO R D S H I V - 1;p r o t e a s e;c l e a v a g es e q u e n c e s;r a n d o
15、 m i z a t i o n;p h a g ed i s p l a y l i b r a r y A c a dJS e cM i lM e dU n i v, 2 0 0 5,2 6(1 1) :1 2 4 3 - 1 2 4 7 基金项目 国家自然科学基金(3 0 4 7 2 0 5 0) ; 上海市科技攻关计划 (0 5 d z 1 9 3 1 7). 作者简介 周 波(1 9 7 2 -) , 男( 汉族) , 硕士. E - m a i l:b o o z h o u1 2 6. c o m. c n *C o r r e s p o n d i n ga u t h o
16、r . E - m a i l: p w p a n w e i y a h o o . c o m. c n 运用高效抗逆转录病毒疗法(h i g h l ya c t i v ea n - t i - r e t r o v i r a l t h e r a p y,HAAR T)治疗A I D S, 可以明 显减少发病率和病死率 1。然而, 抗逆转录酶( R T) 和蛋白酶抑制剂(P I) 耐药H I V变异株的出现是影 响HAAR T治疗效果的主要因素。H I V蛋白 酶 ( p r o t e a s e,P R) 主要通过突变来逃脱P I的作用 2, 病毒为了补偿P R的突变对其
17、切割功能的影响, 在 P R切割位点的氨基酸发生相应的突变,H I VP R在 g a g和g a g/ p o l 基因产物上至少有7个P R切割靶 位点, 每个靶位点都可以发生不同程度的突变, 其中 p 2 /N C处的突变率高达5 2% 3,4。P R对各位点切 割速度也不同, 其中 p 2 /N C、T F P( 转位蛋白) /P R 之间切割速度最快, 而N C/T F P与T F P/ p 6 切割速 1 2 4 4 第二军医大学学报 2 0 0 5年1 1月, 第2 6卷 度最慢 57。 本研究中我们用P C R方法对突变发生频率最 多位置 p 2 /N C切割位点进行随机化,
18、并将该随机化 文库展示于噬菌体表面, 以便应用耐药性突变P R 从文库中筛选其敏感噬菌体, 为研究P R耐药性突 变对其敏感切割序列的影响及构建耐药蛋白酶抑制 剂噬菌体筛选模型奠定基础。 1 材料和方法 1. 1 质粒、 菌种 噬菌粒p C ANTA B 5 S - L D 3是在 噬菌体P蛋白的N端展示I g G高活性结合分子 L D 3的重组噬菌体载体 81 1, 该载体带I g G结合分 子L D 3可用作固相化标记, 将噬菌体文库固定于包 被人I g G的酶标板上, 以便应用P R对该文库进行 切 割 筛 选。p C A P 2 - T、p N C - T质 粒 分 别 为 编 码 H
19、 I V - 1HX B 2株衣壳蛋白(C A) 与P 2蛋白的融合 蛋白(C A P 2) 及核衣壳蛋白(N C) 核苷酸序列(G e n - B a n kN o . A F0 3 3 8 1 9) 克隆于T载体的重组质粒, 上述质粒为本室构建。辅助噬菌体M 1 3 K 0 7, 大肠 杆菌T G 1、T O P 1 0 F , 为本教研室保存。 1. 2 试剂 D NAT a q酶、 P C R溶液D NA回收试 剂盒, 购自上海申能博彩科技公司,T 4 - D NA连接 酶(L i g a t i o nH i g hk i t) 购自T OYO B O公司, 限制性 内切酶S t u
20、和S a l均为T a K a R a公司产品, 辣根 过氧化物酶标记鼠抗M 1 3噬菌体单克隆抗体( a n t i - M 1 3 - HR Pm o n o c l o n a l c o n j u g a t e) 购自Am e r s h a n m P h a r m a c i a公司。质粒D NA提取试剂盒,D NA凝 胶回收试剂盒购自杭州维特洁公司。 1. 3 引物 对H I V - 1C A P 2和N C基因片段进行 P C R扩增及对P 2/N CP R切割位点随机化的引物 见表1。用于扩增C A P 2片段的下游引物C 1 B d - 1 1 t 引入9个N(NNN
21、 NNN NNN) 的随机核苷酸编码 序列对P R切割序列S ATI MM QR G N中的S AT 序列进行随机化, 上游引物C 1 B u - s t u引入S t u、 X b a酶切位点。用于扩增N C片段的下游引物 C 1 L d - 6引入S a l酶切位点, 上游引物C 1 L u - 1 a引 入C A P 2片段3 端重叠区域; 用于测序的下游引物 p C ANTA B 5 - S 6为5 - G TA AATGAA T T TT C T G TAT GAG G - 3 。上述引物委托上海生工生物技 术有限公司合成。 表1 C A P 2、N C扩增和P 2/N C切割位点序
22、列随机化引物 T a b1 P r i m e r s f o ra m p l i f i c a t i o no fC A P 2,N Ca n dr a n d o m i z a t i o no fP 2/N Cc l e a v a g e s i t e C l o n eD e s c r i p t i o nS e q u e n c e C 1 B u - s t uS e n s eo fC A P 25 - G GAG GC C TT C TAGAC C GAT CG T TC AGAA- 3 C 1 B d - 1 1 tA n t i s e n s eo fC
23、 A P 25 - G T TA C CA C GC T GC ATC ATGATNNN NNN NNNG T TG G TAA CC T GAGAC ATA C TT C AC C A - 3 C 1 L u - 1 aS e n s eo fN C5 - AT CAT GAT GC AGC G TG G TAA CT T CC G TAA CC AGC G TAAA AT CG T TAAAT G CT T CAA CT - 3 C 1 L d - 6A n t i s e n s eo fN C5 - G G GG G TC GAC G TTAGC C TGA CG T TC G GT
24、G CAG TC - 3 T h em u t a t i o ns i t e sa r eu n d e r l i n e d;N=A/T/C/G 1. 4 重组基因C A P 2与N CP C R的扩增制备 以 p C A P 2 - T质 粒 为 模 板 分 别 用 引 物C 1 B u - s t u和 C 1 B d - 1 1 t扩增C A P 2片段; 以p N C - T质粒为模板 分别用引物C 1 L u - 1 a和C 1 L d - 6扩增C A P 2片段, P C R扩增条件为9 44 0s;5 64 0s;7 26 0s;3 0 个循环, T a q 酶( 5
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