LICD2基因缺陷导致肺炎链球菌毒力下降.pdf
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1、研究原著文章编号: 1000-2790 (2006) 02-0108-05 licD2 基因缺陷导致肺炎链球菌毒力下降 蓝 锴, 单幼兰, 袁 军, 孟江萍, 张雪梅, 尹一兵 (重庆医科大学医学检验系, 重庆 400016 = ) 收稿日期: 2005-04-26; 接受日期: 2005-09-20 基金项目: 国家自然科学基金资助 (30371275, 30471838) 通讯作者: 尹一兵. Tel: (023) 68485658 Email:yibingyin21cn. com 作者简介: 蓝 锴. 硕士生 (导师尹一兵) . Tel: (023) 89014287 Email:Lan
2、kai1979126. com Deletion of licD2 gene leads to reduced virulence of Streptococcus pneumoniae LAN Kai,SHAN You-Lan, YUAN Jun, MENG Jiang-Ping, ZHANG Xue-Mei,YIN Yi-Bing Department of Laboratory Medicine,Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016,China 【Abstract】 AIM:To assess the role
3、 of licD2 gene in the viru- lence of Streptococcus pneumoniae. METHODS:licD2-deficient strain was constructed and identified by PCR. Relative quantita- tive RT-PCR was applied to measure the expression levels of viru- lent factors and the virulence was studied by mice survival test. RESULTS:The expr
4、ession of virulent factors in licD2-deficient strain was lower than that of wide-type strain(P 14 d,P 0. 5, 然后用无菌 PBS 稀 释到菌密度为 5 1010cfu/ L. 将 48 只 BALB/ c 小鼠 随机分为两组, 分别注射 100 L 野生株和缺陷株菌 液. 分别在注射菌液后12, 24, 36, 48 h 取小鼠心脏 血, 每个时间段 6 只小鼠, 系列稀释后, 野生菌株血标 本接种于 TSA 血平板, 缺陷菌株血标本接种于含氯 霉素 TSA 血平板 (2. 5 mg/ L
5、) . 37, 50 mL/ L CO2孵 箱培养 24 48 h, 菌落计数, 观察细菌在体内被清除 情况. 最终结果以 6 只老鼠血液中细菌计数的平均 值表示. 统计学处理:数据以 x s 表示, 方差齐同时采 用配对 t 检验, 方差不齐时采用 t检验, P 14 d. 两者毒力具有显著性差 异 (Long-rank 分析:x2=43.98,P 0.001) . & 1:pEVP3-licD2/ Hind酶切;M:DNA marker. 1:pEVP3;2: pEVP3-licD2;M:DNA marker. 图 2 重组质粒 pEVP3-licD2 的酶切鉴定& 和 PCR 鉴定 1:
6、$licD2(500 bp) ; 2:pEVP3-licD2 (500 bp) ; 3: 31203 (阴性) ;4: pEVP3 (阴性) ;M:DNA marker. 图 3 缺陷菌株 PCR 鉴定 表 2 S. pn 31203 和$licD2 转化力比较(n =3,%,x s) 处理31203$licD2 同时加入 CSP 和 CPM8 DNA19. 4 0. 80. 0 0. 0a 加入 CSP 10 min 后加入 CPM8 DNA21. 8 0. 90. 6 0. 1a aP 0. 05 vs S. pn 31303. 1: 31203 的基因 lytA 和16 s 的 mNRA
7、 表达; 2:$licD2 基因 lytA mR- NA 和 16 s rRNA 的表达;3:31203 的基因 nanA 和 16 s 的 mRNA 表 达; 4:$licD2 基因 nanA 和 16 s 的 mRNA 表达; 5: 31203 的基因 ps- pA 和 16 s 的 mRNA 表达;6:licD2 的基因 pspA 和 16 s 的 mRNA 表 达; 7: 31203 的基因 ply mENA 的表达; 8: 31203 的 16 s 的 mRNA 表 达; 9:licD2 的基因 ply 的 mRNA 表达;10:$licD2 的 16 s 的 mRNA 表达;M:分
8、子大小 maker. 图 4 S. pn 31203 和$licD2 毒力因子 mRNA 水平 011 第四军医大学学报 (J Fourth Mil Med Univ) 2006; 27 (2) http: / / journal. fmmu. edu. cn 表 3 Quantity-one 3. 0 软件分析的毒力基因表达量与相应 16 s rRNA 表达量的比值(n =3,x s) S. pnlytApspAplynanA 312031. 52 0.030.82 0.071.07 0.050.83 0.01 $licD21.40 0.04a0.69 0.01 0.78 0.06a0.65
9、 0.02a aP 0. 05 vs S. pn 31203. 2. 4 S. pn 体内清除时间测定 在注射野生株菌液 后 48 h, 小鼠体内仍有较高的细菌密度, 而缺陷菌在 小鼠体内经 36 h 后大部分都已被清除, 经 48 h 后体 内的缺陷菌几乎完全被清除,缺陷菌的清除速度明 显快于野生菌 (表 4) . 表 4 S. pn 在小鼠体内清除情况(n =6,lgcfu/ mL ,x s) S. pn12 h24 h36 h48 h 312036.49 0.425.84 0.465.34 0.924.54 0.67 $licD25.93 0.32 4.36 0.21a2.51 0.19
10、a0.00 0.00a aP 0. 05 vs S. pn 31203. 3 讨论 基因缺失技术是目前研究基因功能的最佳方法, 而插入复制失活方式是在对细菌基因功能研究中常 采用的方式. 这种方式主要是利用携带有目的基因 某一段序列的穿梭质粒, 通过同源重组方式整合到宿 主菌染色体上, 从而使该基因断裂, 不能产生活性产 物, 根据穿梭质粒上的抗性标记, 就可以筛选出缺陷 菌株. 这种方式简单易行, 本研究就是将 licD2 基因 的一段序列克隆到穿梭质粒上 pEVP3 上, 再转化肺 炎链球菌, 从含有氯霉素的血平板上得到了缺陷 菌株. 从几种毒力基因的 mRNA 表达来看, 胆碱缺陷 后几
11、种毒力因子的表达均下降, 其中不仅有 CBPs 类 的毒力因子 LytA 和 PspA, 还有非 CBPs 类的毒力因 子 Ply 和 NanA. LytA 使链球菌自溶从而释放出内部 的各种因子, 触发宿主炎症反应等 7. PspA 可减少 补体在细菌表面沉积, 利于细菌在体内增殖 7. Ply 是一种存在于胞质中的多功能蛋白毒素, 一般认为 Ply 在 LytA 诱导细菌自溶后才被释放, 能引起细胞溶 解, 激活补体等多种效应, 其作用属于膜损伤类毒素, 可造成细胞损伤 8. NanA 位于细菌表面, 能清除细 胞表面的多糖如黏蛋白、 糖脂和糖蛋白, 破坏宿主细 胞的糖苷, 促进细菌定植后
12、向宿主侵袭 7. 这些毒力 因子都在 S. pn 致病过程中发挥着重要作用, 而 licD2 缺陷后这些对链球菌黏附、 侵袭具有重要作用的毒力 因子表达量都明显下降, 这可能是细菌毒力下降的原 因之一. 从小鼠毒力实验的结果来看, licD2 缺陷菌致病 力显著降低, 小鼠存活时间明显延长; licD2 缺陷菌在 小鼠体内的浓度也明显低于野生菌, 说明缺陷菌在体 内很快被巨噬细胞等清除, 难以像野生菌一样在体内 大量存活. 而 S. pn 引起肺炎、 脑膜炎等疾病都必须 先黏附于内皮细胞再侵袭进入到宿主细胞内, 一旦体 内存活的细菌减少, 能够黏附侵袭到宿主的细菌也会 相应减少, 很难再进一步
13、引发其他疾病. 这也揭示了 胆碱缺陷后 S. pn 毒力下降的一个重要原因. licD2 缺陷后细菌的转化力明显下降甚至消失. S. pn 的转化调控着一大批基因的表达, 当进入感受 态后, 可启动相当量蛋白表达, 同时也有大量的蛋白 表达被关闭 9. 最近的研究发现 S. pn 转化缺陷菌株 的 LytA,NanA,透明质酸酶三种毒力因子的表达较 野生菌株减弱, 提示细菌的转化有利于其毒力基因的 表达 10. 这说明 licD2 缺陷不仅直接造成几种重要 毒力因子的表达下降, 还有可能通过影响 S. pn 的转 化力来间接影响细菌毒力. 本研究结果表明 licD2 基因从多方面影响着细 菌毒
14、力, 为从基因的角度研究胆碱在链球菌致病过程 中的重要作用提供了最基本的实验依据. 而其与细 菌自然转化的密切联系提示其可能与肺炎链球菌的 条件致病相关, 为进一步研究肺炎链球菌条件致病的 发病机制提供了新的思路. 【参考文献】 1 The vaccine impact surveillance network-invasive pneumococcal study group. Are current recommendations for pneumococcal vacci- nation appropriate for Western AustraliaJ ?Med J Aust,20
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