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1、书书书 文章编号: 1000-5404 (2005) 22-2245-03 论著 ORC1 在大鼠血管平滑肌细胞增殖过程中的表达 江明宏, 舒茂琴, 覃跃龙 (第三军医大学西南医院心血管内科, 重庆市介入心脏病学研究所, 重庆 400038) 提 要:目的 检测不同增殖状态大鼠血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells,VSMCs) 中起始识别复合物 1 (origin recognition complex 1,ORC1) 的表达。方法 采用组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉原代培养 VSMCs; 提取细胞总 RNA, 应用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 技术
2、测定不同增殖状态 VSMCs 中 ORC1 mRNA 表达; 采用免疫荧光、 激光共聚 焦显微镜检测不同增殖状态 VSMCs 中 ORC1 蛋白表达。结果 经光镜、 免疫荧光鉴定证实分离培养的细胞为 VSMCs; 处 于静止状态的 VSMCs 无 ORC1 mRNA 表达, 血清刺激 6 h 后 ORC1 mRNA 表达量明显增加, 12 24 h 达到高峰, 继后逐渐 减少; 处于静止期的 VSMCs 无 ORC1 蛋白表达, 处于增殖状态的 VSMCs 中有大量 ORC1 蛋白表达。结论 ORC1 可能在 VSMCs 增殖过程中起重要作用。 关键词:起始识别复合物; 血管平滑肌细胞; 细胞
3、增殖 中图法分类号:R322. 12;R329. 28;R341文献标识码:A Expression of ORC1 during proliferation of vascular smooth muscle cells in rats JIANG Ming-hong,SHU Mao-qin,QIN Yue-long(Department of Cardiology,Southwest Hospital,Third Military Medical Universi- ty,Chongqing 400038,China) Abstract:Objective To explore origi
4、n recognition complex 1(ORC1)expression in the rat vascular muscle cells at different phases of proliferation. Methods Vascular smooth muscle cells(VSMCs)of thoracic aorta of rats in primary culture were obtained by the adherence method of tissue culture. Total RNA of VSMCs was extracted. The expres
5、sion of ORC1 mRNA of VSMCs at different phases of proliferation was determined by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and the expression of ORC1 protein by immunocyto- chemistry and laser confocal microscopy. ResuIts Cultured VSMCs were confirmed by light microscope and immunocyto
6、chemistry. The expression of ORC1 mRNA in the quiescence stage of VSMCs was not found. After VSMCs were stimulated with serum,the level of ORC1mRNA had an obvious increase at 6 h,peaked at 12 to 24 h and decreased in the following 24 h. The expression of ORC1 protein was also not found in the quiesc
7、ence stage of VSMCs,but the level of ORC1 protein during proliferation of VSMCs was significantly increased. Con- cIusion ORC1 may have an important role during the process of VSMCs proliferation in rats. Key words:origin recognition complex;vascular smooth muscle cells;cell proliferation 血管平滑肌细胞 (v
8、ascular smooth muscle cells, VSMCs) 增殖是动脉粥样硬化和再狭窄发生发展过程 中主要病理机制之一, 而细胞周期进展是增殖信号转 导最终的共同通路。起始识别复合物 (origin recogni- tion complex,ORC) 是真核细胞 DNA 复制起始蛋白。 ORC 最早在酵母菌中发现, 酵母菌中的 ORC 是启动 基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30470727) Supported by the National Natural Science Foundation of China(30470727) 作者简介: 江明宏 (1975 - )
9、 , 男, 江西省永新县人, 硕士研究生, 医师, 主要从 事动脉粥样硬化发病机制的基础方面的研究。电话: (023) 60636004 通讯作者: 舒茂琴, 电话:(023) 68754223,E-mail:Shumaoqin sina. com. 收稿日期: 2005-07-28; 修回日期: 2005-10-23 DNA 复制的关键因子 1。ORC 由 6 个亚单位 (ORC1- 6) 组成, 最小的亚单位为 ORC6, 最大的亚单位为 ORC1。近年来国外研究表明, 越来越多的细胞、 组织 中存在 ORC, 人类不同组织 (如肺、 甲状腺、 小肠、 结肠 粘膜、 睾丸、 肾脏、 脾脏、
10、 心脏等) 有不同的亚单位和蛋 白表达 2。本研究分离 SD 大鼠胸主动脉 VSMCs 并 进行体外培养, 检测在不同增殖状态下 VSMCs 的 ORC1 表达情况, 为进一步研究 ORC1 在动脉粥样硬 化、 血管再狭窄等病理过程的作用奠定基础。 1 材料与方法 1. 1 材料 SD 雄性大鼠每组 2 只, 体质量 120 150 g, 由第三军医大 5422 第 27 卷第 22 期 2005 年 11 月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE Vol. 27,No. 22 Nov. 2005 学实验动物中心提
11、供; ORC1 引物由上海基康生物工程公司合 成: P1: 5-ACGCAATGAAGTCTCTGGAATGTG-3, P2: 5-ACGG- GCACGAAGAGAAGTATGGA-3; 本 实 验 主 要 的 试 剂 如 下: DMEM (高糖型) 培养基 (GIBICO 公司) 胎牛血清 (杭州四季 清) , RT-PCR 试剂盒 (TaKaRa 公司) , TRIpure 法试剂盒 (ROth 公司) , 小鼠抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体 (SMA, 武汉博士德 公司) , 小鼠抗 ORC1 单克隆抗体 (Santa Cruz 公司) , FITC 标记 抗小鼠 IgG, 罗丹明标记兔抗
12、山羊 IgG (北京中山公司) 。 1. 2 方法 1.2. 1 大鼠 VSMCs 的培养 参照文献 3 采用组织块贴壁 法进行 VSMCs 培养。实验采用第 5 8 代细胞。当细胞长至 70%融合时采用无血清 DMEM 行饥饿法培养24 h, 然后换用含 10%胎牛血清的 DMEM 继续培养, 按需要取不同时相的细胞进 行实验。 1. 2. 2 VSMCs 胞鉴定 形态学鉴定: 倒置显微镜下观察 细胞形态及生长方式; 免疫荧光鉴定: 一抗为小鼠抗平滑肌 肌动蛋白单克隆抗体, 二抗为绿色荧光标记的抗小鼠 IgG。 1. 2. 3 ORC1 mRNA 表达的检测 分别于静止期、 血清刺激 后 6
13、、 12、 24、 48 h 提取总 RNA, 进行 RT-PCR 检测。具体步骤如 下: 总 RNA 提取: 弃去细胞培养液, 室温下每 10 cm2细胞生 长面积 (不论细胞数量) 加 1 ml Tripue 按试剂盒说明书抽提总 RNA, 紫外分光光度计测定 RNA 浓度、 纯度符合要求后, 进行 逆转录。cDNA 合成: 反应体系中按以下顺序取量 (参考 TaKaRa 公司试剂盒) : MgCl22 l, 10 RT Buffer 1 l, Rnase Free dH20 3. 75 l, dNTP Mixture 1 l, RNase Inhibitor 0. 25 l, AMV R
14、everse Transcriptase 0. 5 l, Oligo dT-Adaptor Primer 0. 5 l,RNA 样品 1 l(1 g total RNA) 混匀后, 按 30 10 min, 42 30 min, 99 5 min, 5 1 min 行反转录反应。立 即使用或于 -20 深冻保存。PCR 反应: 用大鼠 ORC1 mR- NA 引物扩增 cDNA 片段, 并与内参对照 (-actin) 同时扩增检 测转录效率。建立 50 l 的扩增反应体系, 反应条件为 94 2 min 1 次, 然后 94 30 s, 52 30 s, 72 延伸 1 min, 共循环 35
15、 次。RT-PCR 产物用 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭显色 扫入凝胶系统进行成像。 1. 2. 4 ORC1 蛋白表达的检测 VSMCs 爬片培养, 分别于 静止期、 血清刺激后 12 h 用 4% 多聚甲醛固定, 进行小鼠抗平 滑肌肌动蛋白单克隆抗体 (SmA)和 ORC1 蛋白表达的双标 免疫荧光、 激光共聚焦检测。一抗为小鼠 SmA 和小鼠抗 ORC1 单克隆抗体, 二抗为绿色和红色荧光标记的抗小鼠 IgG。 2 结果 2. 1 VSMCs 培养及鉴定 倒置显微镜下观察: VSMCs 呈梭形, 有 1 2 个核仁, 密度 较高时呈 “峰-谷” 状生长 (图 1) 。用 SMA
16、 单克隆抗体进行免 疫荧光鉴定, 在荧光显微镜下全部细胞胞浆可见绿色荧光 (图 2) , 证实培养的细胞为 VSMCs。 2. 2 不同生长状态 VSMCs 的 ORC1 mRNA 表达 如图 3 所示, 饥饿培养 24 h 后, 处于静止状态的 VSMCs 无 ORC1 mRNA 表达, 血清刺激后 6 h 其表达明显增加, 12 24 h 达到高峰, 其后减少, 即 ORC1 mRNA 在 401 bp 处条带表达。 内参对照 -action 在 318 bp 处有区带。 图 1 VSMCs 的光镜照片 ( 100) Fig 1 Morphologic character of vascu
17、lar smooth muscle cells under light microscope ( 100) 图 2 VSMCs 的 SMA 免疫荧光鉴定 (Fluorescence 100) Fig 2 SmA expression of vascular smooth muscle cells by immunocytochemistry (Fluorescence 100) M:DNA marker; 1 - 5:At 0, 6, 12, 24 and 48 h after serum stimulation 图 3 不同生长状态 VSMCs 的 ORC1 mRNA 表达 Fig 3 Ex
18、pression of ORC1 mRNA in VSMCs at different phases by RT-PCR 2. 3 不同生长状态 VSMCs 的 ORC1 蛋白表达 SMA 荧光标记为绿色, ORC1 蛋白荧光标记为红色。如 图 4 所示, 饥饿培养 24 h 后, 处于静止期 VSMCs 的 SMA 表达 呈阳性, 但无 ORC1 表达, 双通道叠加呈绿色 (仅为 SMA 阳性 6422 第 三 军 医 大 学 学 报 第27 卷 第 22 期 江明宏, 等. ORC1 在大鼠血管平滑肌细胞增殖过程中的表达 表达) ; 血清刺激后 12 h, 处于增殖状态的 VSMCS 中
19、SMA 和 ORC1 均有大量表达, 双通道叠加呈黄色。 A:Expression of SMA in quiescent VSMCs;B:Expression of ORC1 protein in quiescent VSMCs; C: Image overlapping of A and B; D: Ex- pression of SMA in proliferative VSMCs;E:Expression of ORC1 in proliferative VSMCs;F:Image overlapping of D and E 图 4 SMA 和 ORC1 蛋白表达的双标激光共聚焦检测
20、 (flures- cence 400) Fig 4 Expression of SMA and ORC1 by immunocytochemistry and laser confocal microscopy (flurescence 400) 3 讨论 1992 年 Bell 等 4从酵母菌中发现 ORC, 认为 ORC 由 6 个不同的亚单位组成, 即 ORC1、 ORC2、 ORC3、 ORC4、 ORC5、 ORC6, 它们最初都是以 ATP 依赖 方式结合在自主复制序列上, DNA 复制起始点由含 11 对保守序列的碱基和有关的其它元件组成。同源复合 体研究表明 ORC 存在于所
21、有的真核生物中。人类 ORC 有 6 个亚单位 ( ORC1-6) , 最 小 的 亚 单 位 为 ORC6, 最大的亚单位 ORC1, 人类 ORC1 的丰度呈现细 胞周期特异性波动 (被称为 ORC1 周期) , 而 ORC2-5 在整个细胞周期中保持稳定 1。 Ohtani 等 5研究发现, 人类 293 细胞株 ORC1 基 因的表达与细胞增殖密切相关, 即通过血清饥饿法, 在 静止期 ORC1 mRNA 表达非常低, 血清刺激后 12 h 后 ORC1 开始增加, 20 h 后达到高峰。Ohta 等 6, 7报道进 一步发现, ORC1 随细胞增殖过程而变化, 人类的 293 细胞、
22、 HelaS3 细胞以及 HEp-2 细胞, 在血清饥饿状态 下即静止期表达非常低, 血清刺激 12 h 后, ORC1 表达 开始升高, 18 h 达高峰, 18 27 h 后 ORC1 表达逐渐减 少。以上 结 果 提 示, ORC1 在 人 类 肿 瘤 细 胞( 如 HeLaS3 细胞、 293 细胞) 的增殖过程中起重要作用。 具有增殖潜能的 VSMCs 是否有 ORC1 表达, 少见 文献报道, 本研究通过 RT-PCR 检测技术, 结果显示处 于血清饥饿状态 (即静止期) 的 VSMCs 未检测出 ORC1 mRNA 表达, 提示不表达或者表达非常弱, 而 VSMCs 被血清刺激
23、6 h 后, 其 ORC1 mRNA 的表达明 显增加, 12 24 h 达到高峰, 其后逐渐减少。双标激 光共聚焦显微镜蛋白检测显示血清饥饿培养 24 h 后, 处于静止期 VSMCs 仅有 SMA 特异性表达、 而无 ORC1 表达; 血清刺激 12 h 后 VSMCs 处于增殖状态, 其 SMA 和 ORC1 蛋白质均有大量表达, 双通道叠加 呈黄色。本研究结果提示具有增殖潜能的 VSMCs 同 样存在 ORC1 mRNA 和蛋白质的表达, ORC1 的变化与 细胞增殖密切相关, ORC1 在血清饥饿状态下表达非 常低或者不表达, 处于增殖期的 VSMCs 存在 ORC1 大 量表达或者
24、高表达。 VSMCs 属于增殖潜能的细胞, 正常情况下位于血 管中层、 处于静止期, 而在某些情况下 (如血管内皮受 损、 某些趋化因子的作用及冠脉介入治疗后) 血管中 层的 VSMCs 可以发生游走移动、 进入血管内膜、 转化 为增殖状态的细胞, 本研究结果显示静止期的 VSMCs 无 ORC1 表达或或者表达非常弱, 而增殖期的 VSMCs 存在 ORC1 大量或高表达, 提示 ORC1 在 VSMCs 增殖 过程中起重要的调控作用。但 ORC1 在血管平滑肌细 胞中的具体作用机制和关键环节尚不清楚, 需要进一 步深入研究。 参考文献: 1Tatsumi Y,Ohta S,Kimura H
25、,et al. The ORC1 cycle in human cells:I. Cell cycle-regulated oscillation of human ORC1 J . J Biol Chem, 2003, 278 (42) : 41528 -41534. 2Thome K C,Dhar S K,Quintana D G,et al. Subsets of human origin recognition complex(ORC)subunits are expressed in non-proliferating cells and associate with non-OCR
26、 proteins J . J Biol Chem,2000, 275 (45) : 35233 -35241. 3司徒镇强, 吴军正. 细胞培养 M . 西安:世界图书出版公司, 2004. 72 -73. 4Bell S P,Stillman B. ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex J . Nature, 1992, 357 (6374) : 128 -134. 5 Ohtani K,DeGregori J,Leone G,et al. E
27、xpression of the HsOrc1 gene,a human ORC1 homolog, is regulated by cell proliferation via the E2F transcription factor J . Mol Cell Biol,1996,16 (12) :6977 - 6984. 6Ohta S,Tatsumi Y,Fujita M,et al. The ORC1 cycle in human cells: . Dynamic changes in the human ORC complex during the cell cycle J . J Biol Chem, 2003, 278 (42) : 41535 -41540. 7Semple J W,Duncker B P. ORC-associated replication factors as bio- markers for cancer J . Biotechnol Adv, 2004, 22 (8) : 621 -631. (编辑 薛国文) 7422
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