PDECGF特异性RNA抑制片段对膀胱癌细胞作用的研究.pdf
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1、死因子-、 细胞间黏附分子-1 的表达 J . 临床神经病学杂志, 2003; 16 (6) : 350-2. 11 Stanimirovic D,Shapiro A,Wong J,et al. The induction of ICAM-1 in human cerebromicrovascular endothelial cells (HCEC)by ischemic-like conditions promotes enhanced neutrophil/ HCEC adhesionJ . Neuro- immunol, 1997; 76 (1-2) : 193-205. 12 Zhan
2、g RL, Chopp M, Li Y, et al. Anti-ICAM-1 antibody reduces ische- mic cell damage after transient middle cerebral artery occlusion in the rat J . Neurology, 1994; 44: 1747. 13 张 敏, 张 辉 . 七叶皂甙钠对脑缺血和再灌注时大鼠脑组织中 NO 代谢的影响 J . 青岛大学医学院学报, 2003; 39 (3) : 294-6. 2005-03-31 收稿 2005-09-14 修回 (编辑 牛铁兵) PDECGF 特异性
3、RNA 抑制片段对膀胱癌细胞作用的研究 金 宁 孔祥波 (吉林大学中日联谊医院泌尿外科, 吉林 长春 130033) 摘 要 目的 研究 siRNA (small interfering RNA) 对膀胱癌 t24 细胞株 PDECGF 基因表达的抑制作用及对癌细胞增殖和侵袭能力抑制的作 用。方法 体外合成特异针对人 PDECGF 基因的 siRNA; 荧光标记法标记 PDECGF siRNA; 转入 t24 细胞株; 流式细胞术检测 siRNA 的转染效率; west- ern blot 检测 siRNA 对 PDECGF 表达的抑制作用; MTT 法检测 siRNA 对细胞生长增殖抑制作用
4、; Boyden 小室法检测 siRNA 对细胞侵袭能力的影响。 结果 siRNA 转染组 PDECGF 表达水平明显下降。siRNA 转染组细胞生长增殖抑制率随作用时间而增高。siRNA 转染组细胞侵袭能力明显低于对 照组和空载体组。结论 siRNA 能特异有效下调 PDECGF 基因的表达, 能有效抑制膀胱癌细胞增殖及侵袭能力。 关键词 siRNA; 膀胱癌; PDECGF 中图分类号 R739. 7; R73-36 文献标识码 A 文章编号 1005-9202 (2006) 01-0074-03 Effect of RNA interference PDECGF genes on exp
5、ression in the t24 cell lines of bladder carcinoma JIN Ning,KONG Xiang-Bo. Department of Urology,China-Japan Union Hospital of Jilin University,Changchun 130033,Jilin,China 【Abstract】 Objective To investigate inhibition of small interfering RNA(siRNA)on PDECGF gene expression in bladder carcino- ma
6、t24 and carcinoma proliferation and invasion. Methods siRNA aiming human PDECGF gene synthesized in vitro was labeled by fluores- cence and transfected t24 cells. The transfective rate of siRNA were detected by flow cytometry. The inhibitions of siRNA on PDECGF ex- pression,cellular growth and invas
7、ive ability were determined by Western blot,MTT and Boyden cabin method. Results The PDECGF ex- pression in siRNA transfective group obviously decreased. The inhibitive rate of cellular growth and proliferation in siRNA transfective group increased with treated time. The invasive ability in siRNA tr
8、ansfective group was significantly lower than that of control group and no-vector group. Conclusions siRNA of PDECGF genes can effectively down-regulate the expression of PDECGF genes and inhibit the proliferation and invasive ability of t24 cells. 【Key words】 siRNA;PDECGF;Bladder cancer 通讯作者: 孔祥波 (
9、1951-) , 男, 教授, 博士导师, 主要从事泌尿外科临床 研究。 作者简介: 金 宁 (1977-) , 男, 博士, 主要从事泌尿外科肿瘤学的研究。 血小板源性血管内皮生长因子 (PDECGF) 在肿瘤发生发 展过程中起着重要作用, 膀胱癌等癌组织中呈高表达状 态 1 3。该因子除促进新生血管形成外, 还能促进膀胱癌细胞 增殖、 以高其侵袭能力 2, 3。本研究采用 RNAi 技术沉默 PDECGF 基因表达, 通过一系列实验, 在细胞分子水平观察其 对人膀胱肿瘤 t24 细胞株增殖及侵袭能力的抑制作用, 为以后 进行动物体内研究以及膀胱癌的多基因联合干预治疗从基础 研究向临床应用过
10、渡提供可靠的理论基础。 1 实验方法 1. 1 细胞培养与分组 膀胱肿瘤 t24 细胞株 (吉林大学医学 硕士马雪涛惠赠, 购于美国 ATCC) 。DMEM 培养液 (10% 胎牛 血清, 青霉素和链霉素各 100 U/ ml) ,37 饱和湿度条件下培 养。实验前倒置显微镜下观察细胞形态良好, 无退化。将细胞 分为三组: 对照组: 不进行任何转染处理; 空载体组: 转入随机 合成的短链 RNA;siRNA 组: 转入针对 PDECGF 的 siRNA。 1. 2 siRNA 序列的合成 用 Ambion 公司的 Silencer siRNA construction kit 合成针对人 PD
11、ECGF 基因序列特异的 siRNA1。 siRNA1 结合的位点是 687 708。siRNA 的随机译本作为对 照, 命名为 siRNA1S。序列如下: siRNA1:5-GCAGCTTGTGGA- CAAGCAT - 3 ;siRNA1S : AAGGCTCTGACAGGTGGTT。人 PDECGF 基因序列特异 siRNA1 与人 EST (expressed sequencet- ag) 数据库作序列比对, 确认与其他基因无结合位点。严格按 照试剂盒工作手册进行实验操作。体外转录合成 siRNA 后, 紫 外分光光度计定量, -70 冰箱保存备用。 1. 3 FAM 标记 siRNA
12、 体外转录合成 siRNA 后,参照工作手 册, 用 Silencer FAM siRNA Labeling Kit 标记 siRNA。标记后 -70保存, 备用。 1. 4 转染 96 孔板上均匀种植 t24 细胞,待细胞融合后, 按 转染试剂盒说明进行操作。分别用 Opti-MEMI 培养基稀释 47中国老年学杂志 2006 年 1 月第 26 卷 siRNA 和转染试剂, 再以 1 (nmol) : 35 (l) 的比例混合, 进行转 染。转染后 18 24 h 换液一次, 继续培养。 1. 5 MTT 法检测细胞增殖抑制率 分别取 siRNA1 处理 24、 48、 96 h 后的对数
13、生长期 t24 细胞, 接种于96 孔板。于37CO2 培养箱中培养 24 h。小心吸出各孔内培养液。每组设 3 个复 孔, 于 37CO2培养箱中继续培养。培养结束前 4 h, 各培养孔 加入 5 mg/ ml MTT 10 l, 弃上清, 各孔加入 10% 二甲基亚砜 (DMSO) 100 l, 振荡器震荡 10 min, 全自动酶标仪检测各孔吸 光度值 A570nm, 按下列公式计算抑制率: 抑制率 (CI, %)= (对 照组 A570nm- 实验组 A570nm) / 对照组 A570nm 100%。每组均设 3 个复孔 (取平均值作为 1 次实验结果) , 重复实验 3 次。 1.
14、 6 Western blot 转染后 48 h, 将细胞经 0. 25% 胰酶消化, RIPA 细胞裂解液 (50 mmol/ L Tris-Cl,pH 7. 6;5 mmol/ LED- TA; 150 mmol/ L NaCl; 0. 5% NP-40; 0. 5% Triton-X-100,含 1 g/ ml leupeptin,aprotinin 和 antipain;1 mmol/ L NaVO4;0. 5 mmol/ L PMSF) 提取总蛋白。BCA 试剂盒 (Bio-Rad) 检测提取 的蛋白浓度(Bio-RadLaboratories) , 以 30 g 总蛋白行 7. 5
15、% SDS-PAGE 电泳后转移到 PVDF 膜上, 5%脱脂奶粉4过夜封 闭, 依次用 1: 100 一抗和 1: 2 000 稀释辣根过氧化物酶标记的 二抗, 反应, 显色, 重复 3 次。 1. 7 体外侵袭实验 NIH3T3 细胞培养上清作趋化因子, Boy- den 小室上下室之间隔以无 PVP 膜 (Neuo Probe) , 膜上铺50 l 1: 6 稀释的人工基底膜 (Mat rigel, CollaborativeRes) , 上室加入 细胞悬液, 常规培养 10 h, 取出膜 HE 染色, 显微镜下计数穿膜 细胞数。每组设 3 个平行样本。 1. 8 统计学分析 所有的数据
16、结果用 x s 表示,数据的统计 用 t 检验进行分析。 2 结 果 2. 1 流式细胞术结果 siRNA1 处理 t24 细胞 48 h 后, siRNA 的转染效率为(72. 5 6. 1) %。 2. 2 细胞增殖抑制实验结果 siRNA1 处理 t24 细胞 24、 48、 96 h, 其抑制率分别为 (18. 5 5. 6) %、(51. 0 6. 5) %、(82. 2 5. 3) %, 抑制率在 0 96 h 时间范围内随时间的增加而增高 (P 0. 01) 。 2. 3 Western blot 结果 经 PDECGF siRNA 干扰的细胞标本 中,PDECGF 的含量明显降
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