SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化.pdf
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1、文章编号: 1 0 0 2 - 2 6 9 4 (2 0 0 5) 1 2 - 1 1 0 0 - 0 3 S A R S冠状病毒M 蛋白全长基因的 克隆、 表达与纯化 雷明军1, 吴少庭2, 戴五星1, 秦莉1, 潘晖榕1, 袁仕善2, 黄达娜2, 高世同2, 张仁利2, 林绮萍3 摘要: 目的克隆S A R S冠状病毒M蛋白基因编码序列,构建原核重组表达质粒p E T 2 3 a - M,并在大肠杆菌B L 2 1 (D E 3) 中进行表达、 纯化。表达产物用W e s t e r nB l o t检测其抗原性。方法 R T - P C R扩增M编码基因目的片段,胶回收纯化, 插入克隆载
2、体p M D - 1 8 T载体并转化大肠杆菌D H 5 。序列测定后亚克隆至表达质粒载体p E T 2 3 a,构建重组体p E T 2 3 a - M, 转 化大肠杆菌D H 5 。筛选阳性克隆, 以限制性酶切分析鉴定后, 转化大肠杆菌B L 2 1(D E 3) 以异丙基硫代半乳糖苷 (I P T G)进行 诱导表达。用S D S - P A G E与免疫印迹分析表达产物。结果 P C R扩增出约6 7 5 b p的 特异性片段, 与预期片段大小相符, 测序 鉴定无有义突变; 所构建的p E T 2 3 a - M重组体阳性克隆经P C R与双酶切鉴定, 与预期结果一致; S D S -
3、 P A G E显示表达产物约 2 7 k D; 表达产物经金属螯和层析纯化; 免疫印迹表明表达产物能被混合的S A R S病人恢复期血清识别。结论 成功克隆了 S A R S冠状病毒M蛋白基因编码序列, 构建了p E T 2 3 a - M表达质粒, 诱导表达并纯化出了S A R S冠状病毒M蛋白, 并以免疫 印迹鉴定。本研究的成功为进一步进行S A R S病毒诊断试剂与疫苗的开发奠定了基础。 关键词: S A R S;M蛋白; 基因表达; 蛋白纯化; 免疫印迹; 中图分类号: R 3 7 3 . 1 文献标识码: A C l o n i n g , e x p r e s s i o na
4、 n dp u r i f i c a t i o no f t h eMg e n e f r o LS A R SC o r o n a v i r u s L E IM i n g - j u n,WUS h a o - t i n g,D A IW u - x i n g,Q I NL i,P A NH u i - r o n g,Y U A NS h i - s h a n, H U A N GD a n a,G A OS h i - t o n g,Z H A N GR e n - l i,L I NQ i - p i n g (T o n g j iM e d i c a l c
5、 o l l e g e o fH u a z h o n gU n i v e r s i t y,W u h a n4 3 0 0 3 0, C h i n a) A B S T R A C T:T o c l o n e t h eMg e n e o f S A R SC o r o n a v i r u s,e x p r e s s i nE.c o l ia n dp u r i f y t h e e x p r e s s i o np r o d u c t s,t h eMg e n e f r a g - m e n t o f S A R SC o r o n a
6、v i r u sw a s a m p l i f i e da n dc l o n e d i n t o t h ep M D - 1 8 Tv e c t o r . A f t e rn u c l e o t i d e s e q u e n c i n g,t h eMg e n e f r a g m e n t w a s s u b c o l n e d i n t o t h e e x p r e s s i o n v e c t o r p E T 2 3 aw i t h c o r r e c t o r i e n t a t i o n a n d t
7、 h e n t r a n s f o r m e d i n t oE.c o l iD H 5 . T h e p l a s m i d f r o m t h e c o r r e c t e d c l o n e i d e n t i f i e db yP C Ra n de n d o n u c l e a s e d i g e s t i o nw a s t r a n s f o r m e d i n t oE.c o l iB L 2 1 (D E 3) a n d t h e n i n d u c e d f o r e x - p r e s s i
8、o n . T h e e x p r e s s i o np r o d u c tw a sp u r i f i e db ym e t a l - c h e l a t e da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ya n da n a l y z e db yW e s t e r nb l o t t i n g . I tw a s f o u n d t h a t t h e 6 7 5 b p g e n e f r a g m e n tw a s a m p l i f i e d b yR T - P C R. N u
9、c l e o t i d e s e q u e n c i n g s h o w e d t h e r ew a s n o s e n s em u t a t i o n . A2 7 K D p r o t e i nw a s e x p r e s s e da f t e r i n d u c t i o na n dp u r i f i e db ym e t a l - c h e l a t e da f f i n i t yC h r o m a t o g r a p h y .W e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t
10、 i n d i c a t e d t h a t t h e e x p r e s s e dp r o d u c t s c o u l db e r e c o g n i z e db y s e r a o f S A R SP a t i n a t s .Mg e n e o f S A R SC o r o n a v i r u sw a s s u c c e s s i v e l yc l o n e da n de x - p r e s s e d i nE.c o l ia n d t h e e x p r e s s e dg e n e p r o d
11、 u c t sw e r e s u c c e s s f u l l yp u r i f i e da n d r e c o g n i z e db yS A R Sp a t i e n t s i s s e r u m. K E YWO R D S:S A R S;m e m b r a n e p r o t e i n;g e n e e x p r e s s i o n;p r o t e i np u r i f i c a t i o n;w e s t e r nb o l t 2 0 0 2年1 1月, 中国广东省首次发现严重急性 呼 吸 综 合 征(s e
12、v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e S A R S) 的病人。紧接着, 在2 0 0 3年2月, 中国香港 地区也报道了其首例S A R S病例。随后, 该病在世 界范围内迅速流行, 造成了严重的公共卫生危机。 在2 0 0 4年, 中国广东地区再次出现S A R S散发病 例, 使研究者认识到控制S A R S任务的艰巨。目前, S A R S病原体已被确定为一种新型的冠状病毒, 即 S A R S冠状病毒 1 - 6 。S A R S冠状病毒是一种正链 R N A病毒, 已测定了病毒全基因组序列 5 - 7 。一般 认为
13、S A R S冠状病毒具有四种结构蛋白: S蛋白、N 蛋白、 M蛋白与E蛋白。其中M蛋白在其它冠状 病毒中为病毒包膜的主要组成部分, 也是病毒最丰 通讯作者: 吴少庭 作者单位: 1 .华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系, 武汉 4 3 0 0 3 0; 2 .深圳市疾病预防控制中心分子生物室, 深圳5 1 8 0 2 0; 3 .华南农业大学动物医学系, 广州5 1 0 0 8 9 0011 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 2 0 0 5,2 1(1 2) 富的蛋白, 为了进行S A
14、 R S冠状病毒的下一步研究 及其疫苗的研制开发, 我们克隆了S A R S冠状病毒 的M蛋白基因并实现了其在大肠杆菌中的表达并 将其纯化。 1 材料与方法 1 . 1 病毒株、 大肠杆菌菌株和质粒 S A R S冠状病 毒为深圳市疾病预防与控制中心微生物检验科何雅 青副主任技师惠赠。大肠杆菌菌株D H 5 、 B L 2 1 (D E 3) p l y s S为本室保存。p MD 1 8 - T载体购于大连 宝生物公司, p E T 2 3 a表达载体购自N o v a g e n公司。 1 . 2 主要试剂和工具酶 d N T P、T a qD N A聚合 酶、 标准分子量蛋白购于P r
15、o m e g a公司; 病毒R N A 纯化试剂盒Q I A a m pV i r a lR N A M i n iK i t系美国 Q I A G E N公司生产;R T - P C R试剂盒T a K a R aR N A P C RK i tV e r 2 . 1 D N A凝胶回收试剂盒、T 4 D N A连 接酶、 S a lI,B a mH I限制性内切酶、 标准D N A分子 量M a r k e r购于大连宝生物公司; 质粒D N A抽提试 剂盒系华大基因上海鼎安-赛北盛生物科技有限公 司产品; 异丙基硫代半乳糖苷 (I P T G) 、 S D S - N a、E D -
16、T A - N a 2、T r i s碱、 氨苄青霉素系上海生工生物工程 公司产品; H R P标记的羊抗人I g G购于P i e r c e公 司; S A R S病人康复期血清由深圳东湖医院提供; 其 它试剂为国产分析纯。 1 . 3 方法 1 . 3 . 1 病毒R N A的提取与纯化按病毒R N A纯 化试剂盒Q I A a m p ! V i r a lR N AM i n iK i t说明书进 行。 1 . 3 . 2 M基因的扩增与TA克隆 以S A R S冠状 病毒基因组R N A为摸板,按R T - P C R试剂盒试剂 盒说明书以随机引物进行反转录反应。然后使用如 下引物
17、: 5- G G AT C CA T GG C AG A CA A CG G T A C - 3 与5- G T CG A CC T GT A CT A GC A AA G C A A TA T3扩增M基因。反应体系为取1 . 5l 反转录产物, 加入1 0 *P C R缓冲液1 0 l,2 . 5 m m o l L的d N T P8l,2 5 m m o l L的M g C l 28l , 正反向引物 各5 0 p m o lL, T a q聚合酶5 U, 补加d d H2O至总体积 1 0 0l。置P E 9 7 0 0 D N A扩 增 仪 上, 经9 4 变 性 2 m i n后在以
18、下条件下进行扩增反应:9 4 0 3s,5 2 3 0 s,7 2 5 4S, 共3 0个循环; 最后7 2 延伸5 m i n。 产物经1 . 5 %的琼脂糖凝胶电泳检测。并回收纯化 P C R产物, 克隆至p MD 1 8 - T载体中。 1 . 3 . 3 M蛋白原核重组表达质粒的构建 大量提 取重组的p MD 1 8 - T - M质粒, 分别用B a m H和 S a l双酶切切出M基因片段, 在琼脂糖凝胶电泳 后切胶回收并与同样处理的B a m H和S a l双酶 切的p E T 2 3 a连接, 转化大肠杆菌D H 5 , 菌落P C R 鉴定阳性克隆, 抽提质粒D N A, 用
19、B a m H和S a l 双酶切双酶切进一步鉴定并转化大肠杆菌B L 2 1 (D E 3) 。 1 . 3 . 4 M蛋白的表达 接种含重组表达质粒的大 肠杆菌B L 2 1(D E 3) 于少量于含2 0 0 g m l氨苄青霉素 及2 %葡萄糖的L B培养基中, 培养至生长饱和后, 1 : 5 0转 种 并 培 养 至O D6 0 0E0 . 6,补 加I P T G至 0 . 2 m m o l L, 置2 5 诱导表达1 0 h, 离心收集菌体, 重 悬于1 *样品缓冲液中, 1 0 0 水浴处理5 m i n,1 00 0 0 g 离心1 0 m i n, 取上清进行S D S
20、-P A G E电泳分析。 1 . 3 . 5 M蛋白的纯化 接种含重组表达质粒的大 肠杆菌B L 2 1(D E 3) 于少量培养基中, 3 7 培养过 夜; 按1: 5 0稀释转入3 0 0 m lL B中,3 7 培养至 O D6 0 0E0 . 6, 补加I P T G至1 m m o l L, 置2 5 诱导 表达5 h, 离心收集菌体, 重悬于含2 0 m m o lLT r i s - C l,p H 7 . 9,5 0 0 m m o l LN a C l, 1 0 %甘油的缓冲液 中。冰浴超声裂解细菌, 4 ,2 00 0 0 g离心1 0 m i n, 收集上清。参照N O
21、 V A G E N P E T载体手册, 纯化目 的蛋白, 并进行S D S - P A G E电泳分析。 1 .3 . 6 重组M蛋白的抗原性分析在S D S- P A G E电泳后将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜 上, 3 7 封闭2 h (P B S, 3 %脱脂奶粉,0 . 0 5 %吐温 2 0) 。一抗 (混合的1 0份S A R S病人恢复期血清) 用 封闭液1 : 1 0 0稀释, 4 作用过夜,P B S T (P B S, 0 . 0 5 %吐温2 0) 洗4次。酶标二抗为封闭液1 : 5 0 0 0稀释的H R P标记的羊抗人I g G,3 7 作用2 h。 D A B
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