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1、书书书 SARS 冠状病毒多聚酶区抗原在感染诊断中的作用探讨 沈成利 王弋嘉 石 英 闫惠平 吴 昊 赵春惠 周育森 摘 要 目的 原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV) 非结构蛋白 RNA 多聚酶表位区, 了解其在 SARS-CoV 感染 诊断及作为病毒复制指标方面的意义。方法 通过 PCR 扩增获得 RNA 多聚酶表位区基因, 与原核表达载体 pET32a +连接, 转化大 肠杆菌 BL-21 表达获得重组融合蛋白。经切胶透析纯化后, 应用 ELISA 检测 SARS 患者及动物模型血清标本的 IgG 抗体。结果 获 得原核表达的 RNA 多聚酶表位区。ELISA 检测正
2、常人血清均阴性, SARS 患者血清阳性率为95%; 检测 SARS 病毒感染实验动物血 清阳性率100%, 灭活纯化病毒接种恒河猴均为阴性。结论 RNA 多聚酶表位区具有很好的免疫原性, 可用于感染诊断的检测及作 为病毒复制的指标。 关键词 严重急性呼吸综合征; RNA 聚合酶类; SARS 病毒 中国图书资料分类号 R373.1 Prokaryotic expression and application of RNA polymerase of SARS coronavirus Shen Chengli, Wang Yijia, Shi Ying et al. Institute of
3、Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medi- cal Sciences, Beijing 100071, China Abstract Objective To study the antigenicity of RNA polymerase and the relationship between the protein and the SARS-CoV repli- cation. Methods The fragment was amplified by PCR, ligated with the prokaryotic
4、 expression vector pET32a + and transformed into E. coli BL-21 . The expressed fusion protein identified by Western-blot and ELISA was used to detect the anti-SARS CoV IgG in different sera. Re- sults The fusion protein was expressed successfully in E. coli BL-21. Detected by ELISA, the positive per
5、centage of the anti-SARS IgG in the healthy donors, patients, infected animals and the rhesus administrated with the inactivated-virus were 0%, 95%, 100% and 0%,re- spectively. Conclusion Good antigenicity was shown in the expressed RNA polymerase. It can be used to diagnose the infection and to dem
6、onstrate the replication of SARS-CoV virus. Key words severe acute respiratory syndrome; RNA polymerases; SARS virus 严重急性呼吸综合征 (SARS) 是由一种新型冠状 病毒引起的急性呼吸道传染病。SARS-CoV 基因组全 长约29 000bp, 其基因组5端约2/3 的区域编码两个病 毒 RNA 聚合酶复合蛋白 (分别由 ORF la 和 ORF lb 编 码) , 其下游的后 1/3 区域编码 4 个病毒结构蛋白 1。 SARS-CoV 的 RNA 依赖的 RNA 多聚酶
7、(RDRP) 即 RNA 聚合酶 (Pol) 是病毒侵入宿主细胞后启动自身生 命活动的重要蛋白质。与其他冠状病毒一样, SARS- CoV 成熟病毒颗粒中并无 RNA 聚合酶存在, 病毒复 制、 转录所需的病毒特有的 RNA 聚合酶是在病毒侵入 宿主细胞后才合成的, 只在病毒扩增中起作用, 并不参 与病毒颗粒的组装, 因此有可能成为药物设计与治疗 的靶点 2。关于此酶的相关研究尚未见报道。我们通 过巴斯德研究所的抗原决定簇分析软件对 BJ01 株病 毒进行分析, 选取 BJ01 序列的第17 704 17 935bp 的 基因片段作为抗原表位基因, 并进行克隆表达, 分析其 抗原性及与 SAR
8、S 病毒复制的关系。 1 材料与方法 1.1 载体质粒及试剂 pMD18-T 载体克隆试剂盒, Ex Taq 聚合酶, T4连接酶, 限制性核酸内切酶 BamH 和 Xho , 蛋白质分子量标准, DNA 分子量标准均购自 TaKaRa 生物工程技术公司; 表达载体 pET32a +由本室 保存, 质粒提取试剂盒购自上海申能博彩生物公司, 玻 璃奶 DNA 核酸回收试剂盒购自博大泰克生物公司。 1.2 SARS-CoV RNA 多聚酶 cDNA 片段扩增 将 SARS 病毒cDNA 片段进行PCR 扩增, 扩增所用上游引 物为: 5-CTGGATCCGCTGTAGCTTCAAAAATC-3,
9、下游 引物为 5-CACTCGAGATTGCGACGTGGTATTTC-3, 均 由上海申能博彩公司合成, 引物包含有 BamH 、 Xhol 酶切位点。反应条件: 94 5min, 然后 94 20s, 55 30s, 72 35s, 35 个循环, 最后延伸 72 7min。然后 1%琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下切胶回收目的片段。 1.3 目的 DNA 基因与载体的连接及克隆 取 pMD- 18T 载体 1l,Solution I 5l, 回收的 PCR 扩增产物 4l, 16 反应16h, 进行目的片段与载体的连接, 并转 化 XL-1 感受态细胞, 在37含羧卞抗生素的培养基上 生长16
10、h。提取质粒, 用 BamH 和 Xho 双酶切鉴定, 作者简介: 沈成利, 硕士生, 主治医师。主要从事传染性疾病的基础与临 床研究。已发表论文10 余篇 作者单位: 100071 北京 军事医学科学院微生物流行病研究所 (沈成 利、 王弋嘉、 周育森) ; 首都医科大学附属北京佑安医院 (石 英、 闫惠平、 吴 昊、 赵春惠) 通信作者: 周育森, E-mail: zhouys01yahoo. com 基金项目: 北京科委中英 SARS 免疫病理学研究重大课题 (编号 H030230100130) 027 解放军医学杂志 2005 年8 月 第30 卷 第8 期 Med J Chin PL
11、A Vol 30 No 8 August 2005 回收扩增的目的 DNA 片段。BamH 和 Xho 双酶切 pET32a + 载体并回收。用 T4DNA 连接酶将酶切的 pET32a +载体和扩增的目的DNA 连接, 即载体pET32a + / Pol。连接产物再次转化大肠杆菌 XL-1 感受态细 胞, 37含羧卞抗生素的培养基上生长 16h, 挑单菌落 培养增菌后, 提质粒, 并用 BamH 和 Xho 酶切及测序 鉴定。 1.4 目的基因表达与蛋白的纯化 将酶切鉴定正确 的 pET32a + / Pol 载体转入大肠杆菌 BL-21 (DE3) 感 受态细胞, 在 37不含抗生素的培养
12、基上生长 16h, 挑取单菌落, 于37振摇16h, 1:100 转接后当 A 值达 0. 6 时 (约3h) , 加入 IPTG (终浓度 1mmol/ L) 诱导至 A 值达 0. 6 时 (3 4h) 收集细菌, 处理样品后, 10% SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白表达情况。将有表达 的 BL-21 菌增菌后大量表达处理菌体, 切胶回收, 透 析纯化。 1.5 Western blot 分析 表达产物经 10% SDS-PAGE 电泳后, 通过电转膜转移至醋酸纤维素膜, 用含 3% BSA 的 PBS-T 封闭过夜, 第2 天漂洗后以1:50 稀释的 病人血清为一抗, 孵育漂洗后加
13、HRT 标记的羊抗人 IgG 为二抗, 漂洗后用 DAB 染色, 观察结果。 1.6 表达蛋白的 ELISA 检测试验 以表达纯化的蛋 白 RNA 多聚酶包被96 孔板 (2g/ ml) , 37过夜, 经含 3%胎牛血清白蛋白的封闭液封闭后加入感染后 15 30 天1:50 稀释的血清, 分别为: 正常人血清、 SARS 患 者血清、 正常鼠血清、 SARS 病毒感染鼠血清、 正常恒河 猴血清、 灭活纯化 SARS 病毒接种恒河猴血清, 孵育洗 板后分别加入相应的酶标记的抗体。抗体稀释、 洗板 及免疫显色均按常规方法进行。以大于正常对照均数 的2.1 倍为阳性结果。 2 结 果 2.1 DN
14、A 多聚酶基因的克隆 经 PCR 扩增出大小为 240bp 的多聚酶 cDNA 基因片段。目的基因与载体连 接后转化 XL-1 菌, 提取质粒双酶切鉴定, 与预期的片 段相符合。目的基因插入 pET32a +载体进行双酶切鉴 定, 获得载体带及目的片段, 且表达质粒目的基因经测 序鉴定与目的基因片段完全吻合。 2.2 DNA 多聚酶蛋白的表达、 鉴定 重组 pET32a + / Pol 载体转化大肠杆菌 BL-21。IPTG 诱导培养4h (A 值 达0.6) , 收集菌体处理后, 10% SDS-PAGE 电泳结果表 明, 转化载体大肠杆菌出现预期包涵体的融合蛋白表 达, 条带大小约为3.1
15、kD (图1) , 表明 RNA 多聚酶表位 得以成功表达。表达产物经 SDS-PAGE 电泳后, 转移 至醋酸纤维膜上进行 Western blot 分析, 目的条带能与 患者血清产生特异反应, 证明表达产物具有很好的免 疫原性 (图2) 。 图1 重组表达及纯化SARS 多聚酶表位SDS-PAGE 凝胶电泳 Figure 1 SDS-PAGE analysis of recombinant protein 1. Induced pET32a + / Pol BL-21; 2. Uninduced pET32a + / PolBL-21; 3. Purified fusion protein
16、; 4. Protein low molecular marker;5. Washed in- clusion body; 6. Supernatant of bacteria extracts 图2 重组 BL-21 大肠杆菌 Western blot 分析 Figure 4 Western blot analysis of the expressed polymerase from recombinant E. coli BL-2 1. Recombinant pET32a + / Pol BL-21 with IPTG induction; 2. Recombinant pET32a +
17、 / Pol BL-21 without IPTG induction; 3. Protein low molecular marker 2.3 ELISA 检测抗 RNA 多聚酶 IgG 抗体 正常献血 员血清样品共 22 份, 其 IgG 抗体 A450nm值为 0.090 0.041, 均为阴性; 40 份 SARS 患者血清的 IgG 抗体 (病 程的第15 25 天采血) A450nm值为 0.340 0.071, 血清 抗体阳性率达95%。 正常 BABL/ c 鼠血清 20 份, IgG 抗体 A450nm值为 0.069 0.006, 均为阴性; SARS 病毒感染的 BALB
18、/ c 鼠 血清30 份, IgG 抗体A450nm值为0.363 0.115, 阳性率达 100%。 正常恒河猴血清 10 只, 血清 IgG 抗体 A450nm值为 0.092 0.010, 均为阴性; 灭活纯化 SARSA 病毒注射恒 河猴6 只, A450nm值为0.100 0.012, 均为阴性。 3 讨 论 SARS 传染性强, 对严重威胁人类健康, 因此, 早诊 127 解放军医学杂志 2005 年8 月 第30 卷 第8 期 Med J Chin PLA Vol 30 No 8 August 2005 断、 早治疗, 以及建立实验动物模型、 研究疾病的发病 机制等, 均成为亟须
19、解决的问题。国内学者已对 SARS 病毒结构蛋白成功地进行了克隆、 表达, 对其特性进行 了较多的研究 3, 4, 证明 S 蛋白具有很好的抗原性及保 护性, 并进行了疫苗的初步研究 5 7。病毒非结构蛋 白在临床诊断上已经有较多的应用, 如在丙型肝炎诊 断试剂盒中加入非结构蛋白 NS3、 NS5 可使诊断的敏感 性和特异性大大提高 8。对 SARS-CoV 的非结构蛋白 研究较少。病毒 RNA 多聚酶序列的保守性高于其他 结构蛋白且其合成具有相对独立性 2。本研究对 SARS-CoV 非结构蛋白 RNA 多聚酶成功进行了原核表 达, Western blot 分析证明此蛋白具有很好的反应性;
20、 ELISA 检测 SARS 患者及病毒感染 BALB/ C 小鼠抗体 阳性率均较高, 病程2 3 周阳性率可达到 95%以上, 说明原核表达的 RNA 多聚酶表位具有较好的抗原性。 RNA 多聚酶与已经成功表达的 S、 M、 N、 E 蛋白 4联合 应用, 可能会提高 SARS-CoV 抗体的检出率。 冠状病毒的 RNA 多聚酶可以看作是病毒复制的 标志, 若检测不到此酶说明没有活病毒感染, 而检测人 体或动物体内针对该蛋白的抗体可确定是否曾经有该 病毒的感染及复制。在动物病毒的研究中, 口蹄疫病 毒的非结构蛋白被认为是区分病毒疫苗接种和自然感 染的理想指标 9。我们用 SARS 病毒感染
21、BALB/ C 小 鼠, 在感染5 周后通过 ELISA 法在血清中检测到较强 的多聚酶抗体, 用灭活纯化的 SARS 病毒接种恒河猴, 检测此抗体均为阴性。故此多聚酶非结构蛋白, 有望 作为活病毒感染动物后病毒成功复制的特异性标志及 进行鉴别的指标。 参 考 文 献 1Ruan YJ,Wei CL,Ee AL et al. Comparative full-length genome se- quence analysis of 14 SARS coronavirus isolates and common mutations associated with putative origins
22、 of infection. Lancet, 2003 , 361 (9371) : 1779 2周伯平, 唐小平, 陆普选. 2004. 传染性非典型肺炎. 北京:人民卫 生出版社, 2004.931 3Xiao X, Chakraborti S, Dimitrov AS et al. The SARS-CoV S glycopro- tein: expression and functional characterization. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 312 (4) : 1159 4Wu HS, Hsieh YC, Su IJ et al.
23、Early detection of antibodies against va- rious structural proteins of the SARS-associated coronavirus in SARS pa- tients. J Biomed Sci, 2004, 11 (1) : 117 5Bukreyev A, Lamirande EW, Buchholz UJ et al. Mucosal immunisation of African green monkeys(Cercopithecus aethiops)with an attenuated parainflue
24、nza virus expressing the SARS coronavirus spike protein for the prevention of SARS. Lancet, 2004, 363 (9427) : 2122 6Buchholz UJ, Bukreyev A, Yang L et al. Contributions of the structural proteins of severe acute respiratory syndrome coronavirus to protective immunity. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,
25、101 (26) : 9804 7Bisht H, Roberts A,Vogel L et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein expressed by attenuated vaccinia virus protec- tively immunizes mice. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101 (17) : 6641 8Vanderpoel CL, Cuypers HTM, Reesink HW et al. Confirmation of hep- atiti
26、s C virus infection by new four antigen recombinant immunoblot as- say. Lancet, 1991, 337 (8737) : 317 9Mackay DKJ. Proceedings of the final meeting of concerted action. Spe- cial issue of the veterinary quarterly. J Clin Sci Eqidemiol, 1998,20 (Suppl 2) : S2 (2005-03-18 收稿 2005-06-14 修回) (本文编辑 周国泰)
27、 消 息 全军妇科泌尿、 盆底重建妇外科手术研讨会通知 由解放军总医院304 临床部主办的全军继续医学教育项目 “妇科泌尿、 盆底重建妇外科手术研讨会” 初步定于2005 年10 月在北 京举行。会议将重点讨论女性尿失禁、 粪失禁的诊治, 盆底重建手术及阴道手术新进展。届时将邀请国内外多位知名专家对妇科泌 尿、 盆底重建和阴道手术领域的最新研究成果及进展作专题报告, 并进行手术演示和录像讲解等。欢迎广大妇产科同仁报名参加, 并 踊跃投稿进行学术交流。 欲参加研讨会者, 可来信、 来电索取通知。联系人: 张迎辉、 沈文洁。地址: 北京市海淀区阜成路51 号解放军总医院304 临床部 妇产科, 邮编: 100037。电话: 010-66867074/071/076。手机: 13681443798, 13552929646。E-mail: swjywf yahoo. com. cn,yongxianlu si- na. com, 13501155165sohu. com。 解放军总医院304 临床部妇产科 2005 年5 月24 日 227 解放军医学杂志 2005 年8 月 第30 卷 第8 期 Med J Chin PLA Vol 30 No 8 August 2005
链接地址:https://www.31doc.com/p-3678521.html