SC-T 3020-2004 水产品中己烯雌酚残留量的测定 酶联免疫法.pdf.pdf
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1、I C s 6 7 . 0 5 0 B 5 0 S公 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 S C / T 3 0 2 0 -2 0 0 4 水产品中己烯雌酚残留量的测定 酶联免疫法 D e t e r m i n a t i o n o f d i e t h y l s t i l b e s t r o l r e s i d u e s i n f i s h e r y p r o d u c t s E n z y me l i n k e d i m mu n o s o r b e n t a s s a y 2 0 0 4 一 0 1 一 0 7 发布 2 0
2、0 4 一 0 3 一 0 1 实施 中华 人 民共 和 国农 业 部 发布 S C A T 3 0 2 0 -2 0 0 4 前 , ,月 口叫国 匀 本标准的附录P l 和附录B均为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准起草单位: 中国水产科学研究院长江水产研究所、 农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心。 本标准主要起草人: 艾晓辉、 刘长征、 邹世平、 徐忠法、 李荣。 S C / T 3 0 2 0 -2 0 0 4 水产品中己烯雌酚残留量的测定酶联免疫法 范围 本标准规定了水产品中己烯雌酚残留量的酶联免疫测定方法。 本标准适用于水产品肌肉中己烯雌酚的测定。 2 规范性
3、引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日 期的引用文件, 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日 期的引用文件, 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 测定的基础是竞争性酶联免疫抗原抗体反应, 所有的免疫反应都在微孔中进行, 加人己烯雌酚标准 或样品溶液、 己烯雌酚酶标记物、 己烯雌酚抗体后, 己烯雌酚与己烯雌酚酶标记物相互竞争己烯雌酚抗 体的结合位点。 结合的己 烯雌酚酶标记物可以 将无色
4、的 发色剂转化为蓝色的产物, 在4 5 0 n m处检测, 吸收光强度与样品中的己烯雌酚浓度成反比, 按校正曲线定量。 4 试剂和材料 本标准所用试剂除标明外, 其他均为分析纯及其更高纯度, 试验用水符合G B / T 6 6 8 2一级水标准。 4 . 1 叔丁基甲基醚: 色谱纯。 4 . 2 石油醚。 4 . 3 二氯甲烷。 4 . 4 甲醇: 色谱纯。 4 5 氢氧化钠: 1 m o l / L . 4 6 磷酸: 6 m o l / L . 4 . 7 2 0 甲醇的2 0 m m o l / L 三经基甲 基氨基甲 烷( T r is ) 缓冲液( p H 8 . 5 ) , 4 0
5、 %, 7 0 0 6 , 8 0 的甲醇溶 液, 此溶液现用现配。 4 . 8 6 7 m m o l / L 磷酸盐缓冲液( p H 7 . 2 ) : 9 . 6 1 g 磷酸氢二钠, 1 . 7 9 g 磷酸二氢钠溶解于蒸馏水, 定容至 1 0 0 0 M L , 此溶液现用现配。 4 . 9 己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒, 参见附录Ao 5 仪器与设备 5 1 5 2 酶 标仪: 波长4 5 0 nn. 离心机: 转速4 0 0 0 r / m in a 氮吹仪。 电热恒温水浴锅。 高速匀浆机。 q斑月只 反J民J工气U S C / T 3 0 2 0 -2 0 0 4 5 . 6
6、 C j8 固 相提取柱: 长6 . 5 c m , 内 径0 . 7 c m . 5 . 7 固相萃取器。 5 . 8 微M漩AN合仪。 5 . 9 振荡器。 5 1 0 微量加样器: 2 0 p L , 5 0 p L , 1 0 0 p L , 2 5 0 p L , 1 0 0 0 p L , 5 . 1 1微量多 通道加样器: 5 0 p L , 1 0 0 p L o 6 样品处理 6 . 1 试样提取 取出鱼、 虾、 蟹、 鳖等水产品肌肉部分, 除净脂肪和结缔组织, 样品切成不大于0 . 5 c mxo . s c mx 0 . 5 c m的小块后混匀, 置冰箱中冷冻备用。 将样
7、品 解冻, 取5 g ( 精确到0 . 0 1 g ) 样品于匀浆机的 玻璃管中, 加1 0 m L 6 7 m m o l / L磷酸盐缓冲 液 ( p H 7 . 2 ) , 充分匀浆, 称取3 g ( 精确到0 . 0 1 g ) 匀浆 组织于2 0 m L 玻璃离心管中, 加人8 m L 叔丁基甲 基 醚, 强烈振荡2 0 m i n , 4 0 0 0 r / m i n 离心1 0 min , 转移出上清液至2 0 m L玻璃离心管中, 再用8 M L 叔丁基 甲基醚重复提取沉淀物, 将两次提取的醚相合并, 7 0水浴蒸发至干。 取7 0 的甲醇1 M L溶解干燥的残留物, 加3
8、m L石油醚洗涤甲醇溶液, 漩涡混合1 m i n , 4 0 0 0 r / m i n 离心1 m i n , 吸除石油醚, 置水浴锅中蒸发甲醇溶液, 用1 M L二氯甲烷溶解, 加1 m o l / L 氢氧化钠溶 液3 m L , 漩涡 振荡后静置, 取出上层氢氧化钠溶液, 加人6 m o l / L 磷酸3 0 0 p L中和提取液, 用q8 固相 提取柱进一步纯化。 6 . 2 样品纯化 将C 8 固 相提 取柱垂直固定, 用3 m L 无水甲 醇洗涤柱子, 再用2 m L 2 0 甲 醇的2 0 m m o l / L T r is 缓 冲 液( 州 8 . 5 ) 平衡柱子,
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