SN-T 1350-2004 牛锥虫病补体结合试验方法.pdf.pdf
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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 3 5 0 -2 0 0 4 牛 锥 虫 病 补 体 结 合 试 验 方 法 P r o t o c o l o f c o m p l i m e n t f i x a t i o n t e s t f o r t r y p a n o s o m i a s i s 2 0 0 4 - 0 6 - 0 1 发布 2 0 0 4 - 1 2 - 0 1 实施 中华人民共和匡 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 层 S N/ T 1 3 5 0 -2 0 0 4 月 1J舌 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家
2、认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 孟广校、 徐彪、 朱咏梅、 生成选。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 S N/ T 1 3 5 0 -2 0 0 4 牛 锥 虫 病 补 体 结 合 试 验 方 法 范 围 本标准规定了牛锥虫病补体结合试验方法。 本标准适用于牛锥虫病的抗体检测。 2 试验材料 2 . 1 器材 9 6 孔“ U“ 型微量板、 1 0 p L 1 0 0 I L可调移液器、 培养箱、 水浴锅, 1 5 mL尖底离心管、 离心机、 1 2 mmX7 5 mm试管。 2 . 2试剂 2 . 2
3、 . 1 溶血素: 从生物制药厂购买, 效价不低于1: 1 5 0 0 , 2 . 2 . 2 补体: 选择成年雄性豚鼠3 只4 只。 绝食6h - - 8h后, 从心脏采血, 分离新鲜血清保存于普通 冰箱中备用。也可以购买冻干补体。 2 . 2 . 3 锥虫病抗原、 阳性血清和阴性血清: 从生物制品厂购买 2 . 2 . 4 绵羊红细胞悬液的制备: 见第A. 1 章。 2 . 2 . 5 巴比妥缓冲液( 简称 V B S ) : 见第 A . 2 章。 2 . 2 . 6 溶血标准比色孔的制备: 见第A. 3 章。 2 . 3 血 清的处理 被检血清、 标准阳性血清和标准阴性血清, 使用前均
4、需 5 6 灭活 3 0 mi n . 3预备试 验 3 . 1 溶血素效价的测定 3 . 1 . 1 配制 1 : 2 0的补体。 3 . 1 . 2 溶血素稀释: 将溶血素用 V B S做 1: 5 0 0 , 1: 1 0 0 0 , 1: 1 5 0 0 , 1: 2 0 0 0 , 1: 1, 3 5 0 0 , 1 4 0 0 0 , 1, 4 5 0 0 , 1 , 5 0 0 0 稀释。 3 . 1 . 3 溶血素 效价 测定: 取9 6 孔“ U “ 型微 量板, 按表1 中 各成分的 量加人务 孔中。 表 1 溶血素效价测定表 5 0 0, 1 :3 0 0 0 , 单 位
5、 为 微 升 成 分 管号 二123456 7 891 0 卜 血 素补 叫 红 细 胞 溶 血 素 稀 释 度 5 0 0 X1 0 0 o x1 5 0 0欠2 0 0 0X2 5 0 0X 又nn门 x介气nn 丫 4 0 0 0义4 5 0 0 X5 0 0 0只1: 1 0 01 卜 血 , 2 52 52 52 52 52 52 52 52 52 52 5 V B S5 05 0S O5 05 05 05 05 05 05 0757 51 0 0 怂 2 52 52 52 52 52 52 52 52 52 502 5 3 %红 细 胞 液 2 52 52 52 52 52 52
6、52 52 511252 52 52 5 S N/ T 1 3 5 0 -2 0 0 4 封板后于 3 7 0C -3 8 放置 3 0 mi n , 5 0 0 g 离心 5 m i n , 检查结果。 3 . 1 . 4 溶血素效价的判定: 在溶血素对照全部溶血、 补体对照和红细胞对照不溶血的情况下, 参照标准 比色孔( 见第 A. 3 章) , 完全溶血的溶血素的最高稀释倍数即为溶血素稀释度, 一般溶血素稀释度为 1 , 2 0 0 0 , 在试验中使用 2 个溶血单位的溶血素。 3 . 2 补体效价的滴定 3 . 2 . 1 补体用 V B S作系3r jj 稀释, 分别为1 : 1
7、0 , 1 : 2 0 , 1 : 3 0 , 1 : 4 0 , 1 : 6 0 , 1 : 8 0 , 1 ! 1 0 0 , 1 1 5 0 , 1:2 0 0 , 1. 3 0 0 . . . . . . . . 3 . 2 . 2 取9 6 孔“ U “ 型微量板, 按表 2 滴定补体效价。 表 2 补体效价测定表( 结果举例)单位为微升 孔 号Iz34 s67ss1 0 补体稀释度 1 :1 01 :2 01 :3 01 : 401 x6 0 I :8 01: 1 0 01 :1 5 01 , 2 0 01 :3 0 0 补体 2 52 52 52 52 52 52 5 2 52
8、52 5 阳 性 血 清 第 一列 血 清 252 52 52 525 25 2 5 2 52 52 5 抗 原2 52 52 52 52 5 2 52 52 52 52 5 第 二 列 血 清 2 52 52 52 5252 52 5 2 52 52 5 VBS25252 52 525 25 2 5 2 52 52 5 阴 性 血 清 第 一 列 血 清 2 525252525 2 5 2 5 2 52 52 5 抗 原252 52 52 5252 52 5 2 5 2 5 2 5 第 二 列 血 清2 525252 52 5 25 2 5 2 52 52 5 V RS2 52 52 52
9、52 5 2 5 2 5 2 52 52 5 震荡混匀后, 于 3 7 保温1 5 min , 2 单位溶血家 2 52 52 5252 5 2 5 2 5 2 52 52 5 3 %红细胞 2 52 52 52 52 52 52 5 2 52 52 5 震荡摇匀封板后, 于3 7 保温 0 min , 以5 0 0 g 离心 5 m m, 参照标准比色孔( 见第A. 3 章) 观察结果. 阳性 血 清 加 抗 原 不 溶不 溶不 溶不 溶不 溶不 溶不 溶不 溶不 溶不 溶 阳性 血 清 未 加抗 原全 溶全 溶全 溶全 溶全 溶部 溶部 溶不溶不 溶不 溶 阴性血清加抗原 全 溶全 溶全
10、溶全 溶全 溶部 溶部溶不 溶不 溶不 溶 阴性血清未加抗原 全 溶全 溶全溶全 溶全 溶部 溶部 溶不 溶不溶不溶 3 . 2 . 3 补体效价的判定: 补体效价是指阳性血清加抗原的孔完全不溶血, 阳性血清未加抗原的孔以及 阴性血清无论有无抗原的孔完全溶血所需补体最小的量即为一个单位补体。本例中一个单位补体为 1: 6 0 稀释度的补体, 正式试验时使用 2 个单位的补体, 即 1 , 3 0稀释的补体。 3 . 3 抗原效价的测定 3 . 3 . 1 取 9 6 孔“ U “ 型微量板, 向各孔中分别加人VB S 2 5 叮 3 . 3 . 2 抗原和阳性血清分别作从 1 , 2 0 -1
11、 , 2 2 0 稀释, 阴性血清作 1 4 稀释, 设抗原、 血清和V B S 对照。 3 . 3 . 3 每孔按不同稀释度的要求加人阳性血清各2 5 y L , 抗原对照不加血清, 用2 5 k L VB S代替。 3 . 3 . 4 每孔中按不同稀释度的要求, 加人不同稀释倍数的抗原 2 5 1 , L, 阳性血清对照不加抗原而用 2 5 , L VB S 代替。 3 , 3 . 5 每孔中加人 2 单位补体 2 5 I L混匀, 3 7 0C感作3 0 m i n , 3 . 3 . 6 每孔加人2 单位溶血素 2 5 1, 工 3 . 3 . 7 每孔加人3 %绵羊红细胞 2 5 ,
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