V6421-APP 过度表达的 PC12 细胞凋亡的信号传导机制.pdf
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1、由国医药舅刊 1 2 1 3 _|_ 2 0 0 8 年第1 0 卷第8 期( 总第6 l 期) V 6 4 2I - A P P 过度表达的P 0 12 细胞凋亡的信号传导机制 安丽荣1 ,郭艳芹t ,金连弘z ( 1 牡丹江医学院红旗医院神经内科,牡丹江1 5 7 0 0 1 ;2 哈尔滨医科大学组胚教研室,哈尔滨1 5 0 0 8 6 ) 了【摘要】目的:研究过焘衾送爻晶v i 荔泛p ;薹茜的琵晶脆羞赢化席菇获基一焉基知蠡藉兰爵蔷霸善i 茹。菇芸:羞建立稳定装运爻鸳 的A p P ,V 6 4 2 1 一A P P 蛋白的细胞株的基础E ,使用M 订、H o e c h s t 3 3
2、 3 4 2 观察在无血清培养2 4 小时餍,1 0 0 p m o l LH 2 0 2 作用2 4 小时对; :P C I 2 细胞豹影响。使嬲W e s t e r n 捡测引起细胞凋亡的过程中可能的相关基因p - i n k ,f a d 的表达。结鬃:通过M T T 和H o e c h s t 3 3 3 4 2 分别证i ;实无血清培养2 4 小时螽氧化应激损伤,V 6 4 2 一L A P P 转染组细胞损伤数目和凋亡数目明驻增加。W e s t e r n 印迹法显示饪凋亡过程巾,过度袭; i 达v “2 l A P p 缀p - J N g 和F a s L 的蛋j 表达明
3、显增多。结论:在氧化应激引起与飚尔茨海默病相关的过度表达v 6 4 2 一脚p 细胞的凋亡过口 i 程巾,P T N K ,F a s L 都参弓细胞凋亡的过程。 镌 ? 关键词lP C I 2 细胞;捌亡;阿尔茨海秋病;J N K 名 ;【中豳分类号】R - 3 3【文献标识码】A【文章编号】1 0 0 9 0 9 5 9 ( 2 0 0 8 ) 0 8 1 2 1 3 - 0 3乏 iA p o p t o t i cM e c h a n i s mi nt h eP C I 2C e l l so fV 6 4 2 I A P Po v e r e x p r e s s i o n
4、一一一点 争 A nL i t o n 9 1 ,G u oY a h q i n l j i nL i a n h o n 9 2 霪 i( 1 D e p a m n e n to fN e u r o l o g y ,H o n g q iH o s p i t a lo fM u d a n j i a n gM e d i c a lc o l l e g eM u d a n j i a n g1 5 7 0 0 1 ,C h i n a ;磊 ; 2D e p a r t m e mo fH i s t o e m b r y o l o g y ,H a r b i nM e
5、 d i c a U n i v e r s i t y ,H a r b i nt 5 0 0 8 6 ,C h i n a ) 缓 :【A B S T R A C T 】o b j e c t i v e :T os n l 曲t h ea p o p t o t i c 矗辨蠢t m n s d u c t i o nm e c h a n i s mc a u s e db yo x i d a t i v es n si nP C I 2c e l l so fA l z h e i m e r si :d i s e a s e - l i n k e dh u m a aV 6
6、4 2 1 - a m y t o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ( a p p ) g e n eo v e r e x p r e s s i o n M e t h o d s :T h eo v e r e x p r e s s i o no ft r a n s f e c t e dA P P ,V 6 4 2 1 - 秀 iA P Pg e n ei nP C I 2c e l lw c T ec o n s t r u c t e d M “ ITa n dH o e c h s t3 3 3 4 2w e r eu s e dt Oo
7、b s e r v ed l eo v e r e x p r e s s i o no fa m y l o i dp r e C U r s o rp r o t e i nO nj ,c e l lv i a b i l i t ya n da p o p t o s i so fh y d r o g e ap e r o x i d e - i n d u c e dP C I 2c e l lw i t h o u tf e t a lb o v i n es e n R T If o r2 4h o u r W c s t e mw a 骘r e e dt Oo b s e r
8、v et h e e x p r e s s i o no fp o s s i b l eg e n ei nc e l la p o p t o t i cp r o c e s s R e s u t 堪:I nt h eV 6 4 2 I A p pt l a r t s f e c t e dg r o u p ,M T I ;a n dh o e c h s t 3 3 3 4 2g s s a ys h o wt h a t 一 i 蟛u r ya n da p o p t o t i cc e l l sw e r eo b v e s u si n c r e a s e d
9、 洫h y d r o g e np e r o x i d e - i n d u c e dP C I 2c e l lw i t h o u tf e t a lb o v i n es e r 啪f o r2 4h o u r I n ! a p o p t o t i cp r o c e s s ,P - j N Ka n dF a s L e s c r eo b v i o u sm o r emt h eV 6 4 2 1 一A P Pt r a n f f e c t e dg r o u pt h a no t h e rg r o u p sb yw e s t e r
10、 nb l o t t i n g ; C o n c l u s i o n :I nP C I 2c e l l so fA l z h e i m e r sd i s e a s e h n k e dh u m a nV 6 4 2 1 一a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ( a p p ) g e n eo v e r e x p r e s s i o n , p 0 N Ka n dF a s L i ;w e r ei nt h ea p o p t o t i cp r o c e s sc a u s e db yo
11、x i d a t i v es t r e s s l ;【K E YW O R D S P C I 2c e l l ;a p o p t o d s ;A t z h e i m e r 7 sd i s e a s e :c - J u nT - t e r m i n a lk i m s e缓 阿尔茨海默病( A l z h e i m e r 7 sd i s e a s e ,A D ) 是由多种因 素引起,以进行性痴呆为主要临床特征的神经系统退行 性疾病。A D 的病因至今不清,a p p 、早老素( p s 一1 、p s - 2 ) 基因 的突变已被证实与A D ,尤其是
12、家族性A D 有重要联系墉。 于是,研究者们利用基因转染技术,开始在细胞或动物上进 一步研究过度表达的相关基因对细胞及动物的影响嗍。 P C I 2 细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤,和某些神经元在发生 上都源自神经嵴细胞,其在形态、生理、生化功能方面接 近于神经元,因此在国内外用作研究神经细胞的模型,广 泛用于神经细胞死亡方式及神经毒理方面的研究 6 1 。本文 的目的是在已经构建的过度表达人的V 6 4 2 I - A P P 蛋白 的P C I 2 细胞的基础上f 7 1 ,氧化应激诱导细胞凋亡,研究引 起细胞凋亡的可能的信号传导机制,从而为深入研究A D 的神经元凋亡机制提供有意义的依据。 1
13、 材料和方法 1 1M T T 法测细胞活力 将对数生长的各组P C I 2 细胞1 0 0 斗L ( 5 x 1 0 5 w e l l ) 密 度接种于9 6 孔培养板上,每组7 孔。3 7 0 C 孵育过夜,细胞 完全贴壁后,处理组用无血清的D M E M 培养基作用2 4 小时,再加入1 0 0 肛m o l L H :O :作用2 4 小时,每孔加入 M T T1 0 9 。L ,继续孵育4 h ,弃去上清,每孔加入二甲基亚 砜1 5 0 9 。L ,在平板振荡仪上3 7 0 ( 2 振荡1 0 m i n ,用酶标仪 5 9 5 n m 波长比色,读取各孔吸光度,测定对各组细胞活力
14、 的影响,以吸光度值A 5 9 5 n m 表示。细胞抑制率= ( 对照组平 均A 5 9 5 n m - 处理组平均A S 9 5 n m ) 对照组平均A 5 9 5 n m 。 1 2H o e c h s t 3 3 3 4 2 检测细胞凋亡 对数生长的各组细胞以1 0 0 0 斗L ( 6 x 1 0 s w e l l ) 密度接 种于6 孔培养板上。3 7 。( 2 孵育过夜后,处理组用无血清的 D M E M 培养基作用2 4 h ,再加入1 0 0 斗m o l LH :0 2 作用 2 4 h 。观察前0 5 h 加入H o e c h s t 3 3 3 4 2 ,在荧光
15、显微镜的紫 光下观察。每组随机选择视野,计数2 0 0 个细胞,重复3 次,计算凋亡率。 1 3W e s t e r n 检测p - J N K F a s L 置于冰上收集细胞,每瓶加入1 0 0 斗L 细胞裂解液 ( 1 m M P M S F ,2 5 1 0 嘞L e u p 叩t h l 1 0 P e p s t a i n , 1 5 0 m M N a c l ,1 N P 4 0 ,O 5 D e o x y c h o l a t e ,0 1 S D S ,P H 8 0 ) 作用 1 h ,超声破碎,4 0 C 1 6 0 0 0 x g 离心1 5 m i n ,收
16、集上清液,用 B r a d f o r d 方法测定蛋白含量。煮沸5 m m ,按蛋白含量测定 结果每孔上样1 0 0 斗g ,进行1 2 S D SP A G E 分离样品。尔 后。3 0 0 m A ,低温2 h 将胶中蛋白以湿法转印至P V D F 膜 上。该膜经封闭剂( 5 牛血清白蛋白B S A ,0 0 5 T w e e n 一 2 0 溶于T B S 中) 4 过夜封闭,次日与溶于T B S T 中的 p - J N K ,F a s L ,A C T I N 多克隆抗体稀释液( 1 :2 0 0 ) 室温孵 育l h ,T B S T 洗5 m i n x 3 次,与辣根酶
17、标记的二抗稀释液 ( T B S T ) 室温孵育l h ,T B S T 洗5 m i n x 3 次,T B S 洗5 m i n x 2 次,用E C L 显色试剂盒在x 一光片上显色,保存。 作者简介:安丽荣( 1 9 7 3 一) ,女,主治医师,博士。研究方向:脑的老化和老年性痴呆。E m a i l - a l i r o n g y a b o o c o n - L c n 万方数据 12 14 C h i n e s eJ o u m a lo fM e d i c i n a lG u i d e 2 0 0 8V o l u m e1 0N o 8 ( S e r i
18、a lN o 6 1 ) 1 4 统计学分析 实验结果用S P S S l 0 0 软件处理,所有试验结果均表 示为,采用方差分析检验方法对数据进行统计。P 0 0 5 ,V 6 4 2 I - A P P 过度表达组( 6 5 + 1 ) , P 0 0 5 ,三组之间无显著性差异。无血清培养2 4 h 后,1 0 0 m o V LH :0 2 作用2 4 l l ,与对照组( 2 3 + 1 5 ) 相比,A P P 过度 考蝴( 3 0 3 5 ) ,P 0 0 1 ,V 6 4 2 I A P P 列掂毒茛赵组( 35 5 4 ) , P O 0 1 ,有显著性差异。A P P 过度
19、表达组与v 6 4 2 I A P P 过 度表达组相比,P O 0 5 ,有显著性差异( 图2 ) 。 ( 3 ) 蛋白质水平检测p - J N K ,F a s L :在各组的1 3 - a c t i n 表达量一致的情况下,采用W e s t e r n 方法检测氧化应激处 理不同时间,细胞内p - J N K ,F a s L 的含量( 图3 ) 。可见在处 理3 0 m i n 时,在A P P 组和V 6 4 2 I - A P P 组P - J N K 表达,而 且变异组V 6 4 2 I A P P 组明显比A P P 组表达增多;在氧化 图3 各组细胞在凋亡过程中基因的表达
20、差异 ( 1 、4 、7 为对照组:2 , 5 、8 为野生型A P P 表达组:3 、6 、9 为变异型V 6 4 2 I A P P 表达组) 应激6 0 m i n 时,A P P 组和V 6 4 2 I A P P 组P - J N K 表达量 基本相同,而对照组未表达P - J N K 。在处理3 0 m i n 时,在 三组都有微量的F a s L 表达;在氧化应激6 0 m i n 时,三组 F a s L 表达明显增加,而且变异组V 6 4 2 I A P P 组明显比 A P P 组和对照组表达量增多。 3 讨论 近年来,越来越多的证据表明,氧化应激介导了神经 细胞凋亡。A
21、D 病人线粒体D N A 氧化损伤较对照组增加 3 倍网。H :O 对细胞的损伤是通过H 2 0 :在代谢过程中产 生活性氧( R O S ) ,R O S 的生成可在众多的细胞系中激活 I N K 激酶的活性并导致细胞凋亡的发生【9 1 。 T N K 属于丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ,M A P I O 的一种,由于T N K 信号传递途径在 细胞应激反应中起重要作用,可被细胞外应激信号激活, 故又被称为应激活化的蛋白激酶( s t r e s sa c t i v a t e
22、dp r o t e i n k i n a s e 。S A P K ) 。在去除神经生长因子的P C I 2 细胞和交感神 经元中,抑制T N K 和c - j u n 的活性可抑制细胞的凋亡即q 。 但是活化T N K 途径引起细胞凋亡的确切机制并不清楚。 F a s F a s L 是近年来又发现的一个重要的细胞凋亡基 因之一,是将凋亡信号转导入细胞内的主要系统之一。研 究发现,应用l N K 抑制剂可阻断F a s L 的诱导表达;采用 F a s F C 但抗中和F a s L ,可以阻止由于N G F 缺失而引起 的细胞凋亡。所以F a s L 被认为是T N K 途径激活后导致
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