ZN2对大鼠不同自主神经节分离神经元P2X受体介导ATP诱导电流的调制作用.pdf
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1、书书书 第 二 军 医 大 学 学 报 A c a dJS e c M i l M e d U n i v 2 0 0 6A p r ;2 7(4) 3 7 3 论 著 Z n 2+对大鼠不同自主神经节分离神经元P 2 X受体介导A T P诱导电流的 调制作用 马 蓓*,倪 鑫( 第二军医大学基础医学部生理学教研室, 上海2 0 0 4 3 3) 摘要 目的:在大鼠颈上交感神经节(S C G) 、 结状神经节(NG) 和耳副交感神经节(O T G) 分离的神经元上, 分别比较了 Z n 2+对P 2 X受体介导 A T P诱导电流的调制作用。方法:用全细胞膜片钳技术观察Z n 2+对以上3种大
2、鼠自主神经节分离神 经元A T P/ - m eA T P诱导电流的调制作用。结果:在S C G的所有神经元上,A T P可以诱发一个缓慢型电流, 同时给予 Z n 2+( 1 0m o l/L) 可以使其反应增大至(14 4 23 4)%, 而 - m eA T P没有此作用。在NG的所有神经元上,A T P和 - m e A T P可以诱发一个类似的缓慢型电流, 同时给予Z n 2+可以使其反应分别增大至( 1 8 01 2)%和(2 6 22 8)%。在O T G的所 有神经元上,A T P可以诱发一个类似的缓慢型电流, 同时给予Z n 2+( 1 0m o l/L) , 对A T P(
3、1 0m o l/L) 诱发的电流无明显影 响;如果将A T P浓度提高至3 0m o l/L,同样浓度的Z n 2+( 1 0m o l/L) 可以抑制A T P电流, 而且随着Z n 2+浓度的增高( 1 0、 1 0 0m o l/L) , 其抑制作用逐渐增强; 如果先给予TN P - A T P(1 0 0n m o l/L) 阻断电流至未给予TN P - A T P组的(2 62)%, 再给 予Z n 2+( 1 0m o l/L) 后, 剩余的A T P电流为单独给予TN P - A T P的(1 2 79)%; - m eA T P也可以诱发一个类似的缓慢型电 流, 同时给予Z
4、n 2+( 1 0m o l/L) 可使其反应增大至(1 4 65)%;Z n 2+( 3 0 0m o l/L) 对A T P和 - m eA T P(3 0m o l/L) 诱发电 流的激活和失活时间常数均无明显影响。结论:(1)Z n 2+对P 2 X受体具有变构性的调节作用, 它可以增强大鼠S C G和 NG 上由P 2 X2和P 2 X2/3受体介导的缓慢型电流。(2) 大鼠O T G上主要表达P 2 X2/3和少量P 2 X2受体, 但Z n 2+对 A T P诱导的电流 有轻度抑制作用, 提示O T G可能存在着P 2 X受体家族的新亚型。 关键词 Z n 2+; 神经节, 自主
5、; 神经元; P 2 X受体;A T P诱导电流 中图分类号 R3 3 8 文献标识码 A 文章编号 0 2 5 8 - 8 7 9 X(2 0 0 6)0 4 - 0 3 7 3 - 0 5 R e g u l a t o r ye f f e c to fZ n 2+ o nP 2 Xr e c e p t o r - m e d i a t e d,A T P - i n d u c e dc u r r e n t si nd i f f e r e n ta u t o n o m i cg a n g l i o n n e u r o n s i nr a t s MAB e i
6、 *,N IX i n( D e p a r t m e n t o fP h y s i o l o g y,C o l l e g eo fB a s i cM e d i c a l S c i e n c e s,S e c o n dM i l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s i t y,S h a n g - h a i 2 0 0 4 3 3,C h i n a) A B S T R A C T O b j e c t i v e:T oc o m p a r et h ee f f e c t so fZ n 2+o n t h eP 2
7、 Xr e c e p t o r - m e d i a t e d,A T P - i n d u c e dc u r r e n t s i nn e u r o n ss e p a r a t e d f r o mr a t s u p e r i o r c e r v i c a l g a n g l i o n(S C G) ,n o d o s e g a n g l i o n(N G) ,a n do t i c g a n g l i o n(O T G).M e t h o d s:W h o l e - c e l l p a t c h c l a m p
8、r e c o r d - i n gt e c h n i q u ew a su s e dt os t u d y t h e r e g u l a t o r ye f f e c t so fZ n 2+o nA T P/ - m eA T P - i n d u c e dc u r r e n t s i n t h e a b o v e 3g a n l g l i o nn e u r o n s . R e s u l t s:A l l S C Gn e u r o n s r e s p o n d e dt oA T P w i t has u s t a i n
9、 e dc u r r e n t,w h i l en on e u r o n sr e s p o n d e dt o - m eA T P;Z n 2+ p o t e n t i a t e d A T P - i n d u c e ds u s t a i n e dc u r r e n t s t o(14 4 23 4)% o f t h eo r i g i n a lv a l u e .A l lN Gn e u r o n sr e s p o n d e dt oA T Pa n d - m eA T P w i t ha s i m i l a r s u s
10、 t a i n e dc u r r e n t;c o a p p l i c a t i o no fZ n 2+( 1 0m o l/L)p o t e n t i a t e dt h e i r r e s p o n s e s t o(1 8 0 1 2)%a n d(2 6 2 2 8)%,r e s p e c t i v e - l y . A l lO T Gn e u r o n s r e s p o n d e dt ob o t hA T Pa n d- m eA T P w i t has u s t a i n e dc u r r e n t . C o
11、a p p l i c a t i o no fZ n 2+( 1 0m o l/L)d i dn o t s i g n i f i c a n t l yp o t e n t i a t e t h e s u s t a i n e dc u r r e n t s i n d u c e db y1 0m o l/LA T P,b u tw h e nA T P w a s a t 3 0m o l/L,Z n 2+( 1 0 - 1 0 0m o l/L) i n h i b i t e dA T P - i n d u c e ds u s t a i n e dc u r r
12、e n t s i nad o s ed e p e n d e n tm a n n e r . I fT N P - A T P(1 0 0n m o l/L)w a s f i r s tu s e dt o i n h i b i tA T P - i n - d u c e dc u r r e n t t o(2 6 2)%o f t h e o r i g i n a l v a l u e,Z n 2+a t 1 0 m o l/Lp o t e n t i a t e d t h e i n h i b i t e d c u r r e n t t o(1 2 7 9)%o
13、 f i t s o r i g i n a l v a l - u e . C o a p p l i c a t i o no f Z n 2+( 1 0m o l/L)p o t e n t i a t e d - m eA T P - i n d u c e d c u r r e n t s t o(1 4 6 5)%o f t h e c o n t r o l . Z n 2+( 3 0 0m o l/L)h a d n oe f f e c t o no na n do f fo fA T P -a n d- m eA T P - i n d u c e d( 3 0m o l
14、/L)c u r r e n t s i nO T Gn e u r o n s . C o n c l u s i o n:(1)Z n 2+i s a na l l o s t e r i c m o d u l a t o ro fP 2 X2a n dP 2 X2/3r e c e p t o r s i nS C Ga n dN Gn e u r o n s a n d c a np o t e n t i a t e t h e c u r r e n t s t h e y i n d u c e d .(2)T h ep r e d o m i n a n t r e - c
15、e p t o rs u b t y p e s i nO T Ga p p e a r t ob eh o m o m e r i cP 2 X2/3a n da l i t t l eP 2 X2. Z n 2+h a s a n i n h i b i t o r y e f f e c t o n t h eA T P - i n d u c e d c u r r e n t s i n O T Gn e u r o n s,s u g g e s t i n gs o m en o v e lm e m b e r so f t h eP 2 Xp u r i n o c e p
16、t o r e x i s t i nt h e s en e u r o n s . K E Y WO R D S Z n 2+; g a n g l i a,a u t o n o m i c;n e u r o n s;P 2 Xr e c e p t o r s;A T P - i n d u c e dc u r r e n t s A c a dJS e cM i lM e dU n i v, 2 0 0 6,2 7(4) :3 7 3 - 3 7 7 基金项目 国家自然科学基金(3 0 5 7 0 5 9 7). S u p p o r t e db yN a t i o n a
17、 l N a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a(3 0 5 7 0 5 9 7). 作者简介 马 蓓, 硕士, 副教授. *C o r r e s p o n d i n ga u t h o r . E - m a i l:M a b e i 2 0 0 4y a h o o . c o m. c n 嘌呤受体可分为P 1( 腺苷) 和P 2(AT P/A D P) 受体, 后 者 又 分 成 两 大 家 族, 即P 2 X和P 2 Y受 体 1。P 2 X受体属配基门控离子通道型受体, P 2 Y 3 7 4 第二军
18、医大学学报 2 0 0 6年4月, 第2 7卷 受体为G蛋白偶联型受体。目前, 已经克隆出7种 P 2 X受体亚型(P 2 X1 - 7) 。大量的P 2 X受体药理学 研究证明, 在大鼠的交感神经节上, 以P 2 X 2同源性 受体表达为主 2,3; 在感觉神经节上, 表达有多种 P 2 X受 体, 其 中 包 括 同 源 性P 2 X3受 体, 异 源 性 P 2 X2/3受体和一部分同源性P 2 X2受体 4; 而在副交 感神经节, P 2 X受体的表达因神经节的不同差异很 大, 如: 大鼠盆神经节以P 2 X 2受体表达为主 5, 耳神 经节以P 2 X 2/3异聚体为主, 下颌下腺神
19、经节同时表 达同聚体P 2 X 2和异聚体P 2 X2/3 6。 不同的P 2 X受体对激动剂、 拮抗剂及其他调制 剂的敏感性不同 79。其中 Z n 2+是一个变构性调 制剂, 可以增强含有P 2 X 2和P 2 X4亚基的受体对 AT P的反应 1 0,1 1, 但对 P 2 X3受体无明显作用。L i 等 1 2首先证明 Z n 2+作用于变构性结合位点, 通过 增强P 2 X 2受体对AT P的亲和力, 明显增强AT P的 诱导电流。后来的研究发现, Z n 2+对P 2 X受体的变 构性调制作用, 不仅决定于受体类型, 还和动物的种 属有关。譬如: 在牛蛙的背根神经节上,Z n 2+
20、通过 作用于变构性结合位点, 减弱P 2 X受体对AT P的 亲和力而发挥调制作用 1 3; 在豚鼠颈上交感神经 节, Z n 2+同样可以抑制 AT P诱发的电流 1 4。 目前, 引起Z n 2+变构性调制差异的原因尚不完 全清楚, 因此我们对包括交感, 副交感及感觉神经节 在内的自主神经节进行了比较研究, 其中分别选用 了大鼠颈上交感神经节( S C G) 、 结状神经节(NG) 和 耳副交感神经节(O T G) 分离培养的神经元, 观察了 Z n 2+对 AT P诱导的内向电流的调节作用, 并进行 了比较, 从而进一步了解Z n 2+对不同 P 2 X受体的 调制作用, 为将来进一步探
21、讨P 2 X受体的新亚型提 供实验依据。 1 材料和方法 1. 1 试 剂 AT P、 - m eAT P、TN P - AT P购 自 S i g m a公司,AT P、 - m eAT P用双蒸水溶解并冷 冻贮存。所有的药物稀释后通过一个自制的7管道 灌流 系 统 并 通 过 重 力 给 予, 其 中 一 管 给 予 正 常 K r e bs液, 用来快速终止给药 6。激动剂每次给予 4s,间隔2m i n。灌流用外液组成(mm o l/L) :N a C l 1 5 4,K C l 4. 7,M g C l21. 2,C a C l22. 5,H e p e s 1 0及 g l u c
22、 o s e5. 6;用N a OH将p H值调成7. 4。记录电 极电阻24M。所充内液组成为(mm o l/L) :K C l 1 2 0,HE P E S1 0,t r i p o t a s s i u mc i t r a t e1 0和E G TA 1 0;用KOH将 p H 值调成7. 2。 1. 2 细胞培养 1 61 8d的S D 大鼠, 3 04 0g。 快速断头致死, 取出S C G、NG和O T G 1 5, 置于 L - 1 5培养液中(L i f eT e c h n o l o g i e s,P a i s l e y,UK) , 将 神经节置于4m l含有1.
23、 5m g/m l胶原酶(C l a s s, W o r t h i n g t o nB i o c h e m i c a lC o r p o r a t i o n,UK) 和6 m g /m lB S A(S i g m a,P o o l e,UK)的 无 钙 无 镁 H a n ks平衡盐溶液 (HB S S,L i f eT e c h n o l o g i e s) 中。在3 7 C的恒温下孵育4 5m i n。然后将神经节 置于4m l含1m g/m l的胰酶 ( S i g m a) 中, 在3 7 C 下孵育1 5m i n。然后用1m l培养液( 由含有1 0%胎
24、 牛 血 清,5 0 n g/m l神 经 生 长 因 子,2 m g/m l N a HC O3,5. 5m g/m l葡萄糖,2 0 0g/m lp e n i c i l l i n 和2 0 0g/m l s t r e p t o m y c i n的L - 1 5培养液组成) 轻 轻吹打直至将神经节分离成单个细胞。将这些细胞 铺在用1 0g/m lL a m i n i n预先涂过的3 5mm的平 皿上。在含有5% C O 2的3 7 C的恒温箱中孵育, 第 2天用于实验记录。 1. 3 电生理记录 常温下进行全细胞膜片钳记录, 所用仪器为A x o p a t c h2 0 0
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