[农业标准]-NYT555-2002 动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法.pdf
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1、I C S 1 1 . 2 2 0 s4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 N Y / T 5 5 5 -2 0 0 2 动物产品中大肠菌群、 粪大肠菌群 和大肠杆菌的检测方法 D e t e c t i o n me t h o d s f o r c o l i f o r m g r o u p , f a e c a l c o l i f o r m g r o u p , c o l i f o r m b a c t e r i a i n a n i ma l p r o d u c t s 2 0 0 2 一 0 8 一 2 7发布2 0 0 2 门 2
2、 一 0 1实施 中 华 人 民 共 和 国农 业 部发 布 4 3 1 N Y/ T 5 5 5 -2 0 0 2 前言 大肠菌群、 粪大肠菌群和大肠杆菌是食品卫生的三项重要的卫生指标。 当前国际上采用的方法有美 国公职分析化学家协会( A O A C ) 方法及日 本人介绍的煌绿乳糖胆盐肉汤( B G L B ) 和E C试管发酵法。 为 满足要求, 依照日 本采用的B G L B和E C试管发酵法并进行适当改进, 建立了本检测方法。 本方法用 B G L B发酵管检测大肠菌群并计算最大可能数( MP N) 值, 用E C肉汤发醉管检测粪大肠菌群并计算 MP N值, 在检测粪大肠菌群的基础
3、上通过生化鉴定检测大肠杆菌并计算MP N值, 鉴定中省去了革兰 氏染色。 这些重要改进缩短了检验时间, 简化了操作程序, 而且经对比试验证明结果可靠, 适合于动物产 品中大肠菌群、 粪大肠菌群和大肠杆菌的检测。 本标准的附录A是规范性附录, 附录B是资料性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位: 天津动植物检疫局。 本标准主要起草人: 秦贞奎、 张碧波、 侯艳梅、 杨金良、 薛振源。 NY / T 5 5 5 -2 0 0 2 动物产品中大肠菌群、 粪大肠菌群 和大肠杆菌的检测方法 1 范围 本标准规定了动物产品中大肠菌群、 粪大肠菌
4、群和大肠杆菌的检测方法。 本标准适用于动物产品中大肠菌群、 粪大肠菌群和大肠杆菌的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 2 . 1 大肠菌群c o l i f o r m s ; c o l i f o r m g r o n p 一群能分解乳糖产酸产气、 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆茵。 2 . 2 粪大肠菌群 f a e c a l c o l i f o r m s ; f a e c a l c o l i f o r m s g r o n p 4 4 . 5 C 发酵乳糖产气的一群细菌, 是用来表示来源于粪便的大肠菌群。 2 . 3 大肠杆菌e s c h e
5、r i c h i a c o l i ; c o l i f o r m b a c t e r i a 符合大肠菌群和粪大肠菌群定义, 用I MV i c ( 靛基质、 甲基红、 维培和西蒙氏柠檬酸盐) 生化试验进 一步鉴定, 四种生化反应结果依次为+一一和一+一一的细菌。 2 . 4 最大可能数 m o s t p r o b a b l e n u m b e r , MP N 采用多次稀释方法所求得的最近似数, 是通过概率计算出来的。 2 . 5 I MVi C 靛基质试验、 甲基红试验、 维培( V P ) 试验和构椽酸盐利用试验的缩写。 3 检测方法 3 . 飞 材料准备 3 .
6、 1 . 1 仪器 吸管, 恒温水浴箱, 培养箱, 匀浆器, 1 0 0 m 1 . , 2 0 0 m L和5 0 0 m L三角瓶及广口瓶, 直径5 m m的玻 璃珠。 3 . 1 . 2 培养基及试剂 配制方法见附录A( 规范性附录) 。 31 . 2 . 1 煌绿乳糖胆盐肉汤( B G L B ) , 配制方法见第 A . 1 章。 3 . 1 . 2 . 2 E C肉汤, 配制方法见第A . 2 章。 3 门. 2 . 3 伊红美蓝琼脂( E MB ) , 配制方法见第A. 3 章。 3 . 1 . 2 . 4 甲基红一 维培( MR - V P ) 培养基, 配制方法见第A. 4
7、章。 3 . 1 . 2 . 5 西蒙氏柠檬酸盐培养基, 配制方法见第A . 5 章。 N Y/ r 5 5 5 -2 0 0 2 3 . 1 . 2 . 6 靛基质( “ 引 噪) 试验培养基, 配制方法见第 A. 6章。 3 . 1 . 2 . 7 科瓦克( Ko v a c s ) 氏靛基质试剂, 配制方法见第 A. 7章 3 门. 2 . 8 甲基红指示剂, 配制方法见第A . 8 章。 3 . 1 . 29 维培( V P ) 试剂, 配制方法见第 A. 9 章。 3 . 2 检测程序 本标准的检测程序见图1 . ,图1 检测程序流程图 3 . 3 样品制备 3 . 3 . 1 无菌
8、操作从动物产品中采取有代裹性的样品 如有包装则用 7 5 %乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检测, 应将冷冻样品置于一1 5 冰箱保 存。非冷冻而易腐的样品, 应置于4 冰箱保存。检测前冷冻样品可于2 一一5 下在1 8 h内, 或于 4 5 下在1 5 m i n内 解冻。 13 . 2 不同样品匀浆液的制备 3 . 3 . 2 . 1 液体样品: 以无菌吸管取样2 5 m L加人到装有2 2 5 m L灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶( 瓶内预 置适当数量的玻璃珠) 内, 制成 1 : 1 0 的样品匀浆。 3 . 3 - 2 . 2 固体和半固体样品: 以无菌操作取样 2 5 g , 加人到装
9、有 2 2 5 m L灭菌生理盐水的灭菌匀浆器 内, 于8 0 0 0 r / m i n 均浆2 m i n , 制成1 : 1 0 样品匀浆( 也可用灭菌乳钵研磨的方式代替) 。 N Y/ T 5 5 5 -2 0 0 2 3 . 3 . 2 . 3 样品稀释液的制备: 根据样品污染情况, 用灭菌生理盐水将样品匀浆制成一系列十倍递增的 样品稀释液( 通常采用 1 0 - , 1 0 - 1 和1 0 - 稀释) 。从制备样品匀浆至稀释完毕, 全过程不得超过 1 5 m i n e 3 . 4 大肠菌群的测定 3 . 4 . 1 大肠菌群MP N值的测定 3 . 4 . 1 . 1 每个样品
10、通常选用 1 0 - 1 , 1 0 - 2 和1 0 - 3 三个连续稀释度的样品稀释液, 每个稀释度接种三管 B G L B ( 见第A . 1 章) , 每管接种1 m L , 每接种一个稀释度换一支无菌吸管。 3 . 4 . 1 . 2 将接种管置于( 3 6 士1 ) 培养2 4 h , 3 . 4 . 1 . 3 观察试管的产气情况: 检查管内是否有气泡产生, 并记录2 4 h内产气的B G L B管数。如所有 培养管均未产气, 则报告大肠菌群阴性; 如有产气管, 进一步试验证实。 3 . 4 . 2 大肠菌群的证实试验 3 . 4 . 2 . 1 将所有产气管中的培养物用接种环接
11、种到伊红美蓝琼脂平板, ( 3 6 士1 ) 培养2 4 h , 3 . 4 . 2 . 2 大肠菌群在伊红美蓝琼脂平板上生长, 其菌落为有金属光泽、 黑紫色或紫色带黑心。 3 . 4 . 2 . 3 查有金属光泽、 黑紫色或紫色带黑心菌落的B G L B产气管数及其稀释倍数。 3 . 4 - 2 . 4 结果报告: 按3 . 4 . 2 . 3 检查结果, 查M P N检索表( 见附录B ) , 报告大肠菌群的M P N / g ( m L ) 值。 3 . 5 粪大肠菌群测定 3 . 5 . 1 粪大肠菌群MP N值的侧定 3 . 5 . 1 . 1 每个样品通常选用1 0 -, 1 0
12、“和i 0 - , 三个连续稀释度的样品稀释液, 每个稀释度接种三管 E C肉汤, 每管接种 1 mL e 15 . 1 . 2 将所有接种的E C肉汤管于 3 0 m i n内置于温度为( 4 4 . 5 士。 . 5 ) 的带盖水浴箱内, 培养( 2 4 士2 ) h 。水浴箱的水面应高于肉汤培养基液面。用4 4 . 5 产气阳性的大肠杆菌和4 4 . 5 不产气的大肠 杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。 3 . 5 . 1 . 3 记录E C管的产气情况。 E C肉汤管都不产气为粪大肠菌群阴性, 产气为粪大肠菌群阳性。 将 产气管作证实试验。 3 . 5 . 2 证实试验 3 .
13、5 . 2 . 1 将产气管接种伊红美蓝平板在( 3 6 士1 ) “C 培养2 4 h . 3 . 5 - 2 . 2 查有金属光泽、 紫色带黑心菌落的E C产气管数及其稀释倍数。 3 . 5 - 2 . 3 结果报告: 按3 . 5 . 2 . 2 结果, 查MP N检索表( 见附录B ) 。 报告粪大肠菌群的MP N / g ( m L ) 值。 3 . 6 大肠杆菌测定 3 . 6 . 1 培养 将 3 . 5 - 2 . 1 中伊红美蓝平板上典型大肠杆菌菌落接种到营养琼脂平板, 在( 3 6 土1 ) 培养 1 8 h - 2 4 h 。 每个平板至少挑选2 个菌落。 3 . 6 .
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