[商检标准]-SNT 1089-2002 布氏杆菌病补体结合试验操作规程.pdf
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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 s N / T 1 0 8 9 -2 0 0 2 布氏杆菌病补体结合试验操作规程 P r o c e d u r e o f c o mp l e me n t f i x a t i o n t e s t f o r b r u c e l l o s i s 2 0 0 2 一 0 3 一 1 5发 布 2 0 0 2 一 0 9 一 0 1 实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 S N / T 1 0 8 9 -2 0 0 2 前言 本标准是按照G B / T 1 . 1 -1 9 9 3 标准化工作导
2、则第 1 单元: 标准的起草与表述规则第1部分: 标准编写的基本规定 而制定的。 本标准参考了原中华人民共和国动植物检疫局编写的 中国进出境动物检疫规范 , 并结合了起草 单位多年的检验检疫经验。 本标准的附录A、 附录B 、 附录 C 、 附录D是标准的附录。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国天津出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 王玉玲、 朱世强、 番蕾、 范华炜。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 布氏杆菌病补体结合试验操作规程 s N / T 1 0 8 9 -2 0 0 2 P
3、r o c e d u r e o f c o mp l e me n t f i x a t i o n t e s t f or br u c e l l o s i s 范围 本标准规定了布氏杆菌病补体结合试验的操作技术要求。 本标准适用于家畜布氏杆菌病的血清学诊断, 其他动物可参考执行。 2引用标 准 下列标准所包含的条文, 通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时, 所示版本均 为有效。所有标准都被修订, 使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法 3 试剂和材料 3 . 1试剂 3
4、 . 1 . 1 试验用蒸馏水为G B / T 6 6 8 2中的三级水。 3 . 1 . 2 稀释液: 生理盐水。 3 门. 3 补体结合抗原: 按说明书使用, 使用前充分摇匀。 3 . 1 . 4 标准阳性血清: 冻干品, 使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 3 . 1 . 5 标准阴性血清: 冻干品, 使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 3 . 1 . 6 溶血素: 冻干品, 使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 3 . 1 . 7 补体: 冻干品, 使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 3 . 1 . 8 3 %绵羊红细胞悬浮液 选健康成年绵羊, 无菌颈静脉采血, 1 . 2 份阿氏液加 1 份血, 混匀
5、, 4 冰箱内保存 5 d后备用。 使用 前摇匀取出所需量, 用稀释液离心洗涤 3次, 每次在水平转子离心机上 2 0 0 0 r / min离心 5 mi n , 最后一 次 1 0 mi n , 除去上清液及白细胞层, 取下沉红细胞泥, 用稀释液稀释成 3 写的红细胞悬浮液。 3 - 2材料 3 . 2 . 1 玻璃试管: 1 0 mmX7 5 m m, 圆底, 洁净。 3 . 2 . 2 试管架。 3 . 2 . 3 微量移液器。 3 . 2 . 4 可调连续加样器。 3 . 3 被检血清 3 . 3 . 1 按常规方法采血和分离血清。 血清必须新鲜, 无蛋白絮凝物, 无溶血, 无腐败气
6、味。 3 . 3 . 2 运送和保存血清 防止血清冻结和受热, 若 3d内不能送到实验室, 可用冷藏方法运送血清。 中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2 0 0 2 - 0 3 - 1 5 批准2 0 0 2 - 0 9 - 0 1实施 1 S N / T 1 0 8 9 -2 0 0 2 4操作方法 4 . 1 预备试验 正式试验前, 将试验的各种成分进行测定。 4 . 1 . 1 配制标准比色管 4 . 1 . 1 . 1 制备 3 %血红素 取 1 0mL3 %红细胞悬浮液, 加到 1 5 ml的刻度离心管中, 水平转子离心机上 2 0 0 0 r / mi n离心 1 0 mi n
7、 , 吸弃上清液, 加蒸馏水到 9 m L, 反复吸打, 液体清亮, 然后加 1 mL8 . 5 抓化钠溶液混匀即可. 4 . 1 . 1 . 2 按表 1 配制标准比色管。 表 1 标准比色管的配制 溶血度 / % 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 0 0 3 %血红素/ .L 00 .0 10 . 0 20 . 0 30 . 0 40 . 0 50 . 0 60 . 0 70 . 0 80 . 0 90 . 1 0 3 %红细胞悬浮液/ mL 0 . 1 00 .0 90 . 0 80 . 0 70 . 0 60 . 0 50 . 0 40 . 0 30 . 02
8、0 . 0 10 稀释液/ .L 0 . 4 00 . 4 00 . 4 00 . 4 00 . 4 00 . 4 00 . 4 00 . 4 00. 400 . 4 00 . 4 0 处理混匀后离心 4 . 12 补体效价的测定 4 . 下2 . 1 试验当天打开若干瓶( 依试验所需量而定) 补体, 用蒸馏水溶解后, 取效价测定所需量作 1 / 2 0 稀释, 余下的补体置 4 C 保存备用。 4 . 1 . 2 . 2 取 7 个试管, 按表2加样, 然后将试验管置3 7 C 水浴箱中, 感作 3 0 min ( 每 5 mi n振荡 1 次) , 水平转子离心机2 0 0 0 r / m
9、 i n离心3 m i n , 与标准比色管比较, 记录溶血度。 表 2 补体效价测定 试管号 1234567 1 / 2 0 补体/ .L 0 . 010 . 0 20 . 0 30 . 0 40. 050 . 0 60 . 0 7 稀释液/ mL 0. 290 . 2 80 . 2 70 . 2 60. 2 50 . 2 40 . 2 3 致敏红细胞/ -L 0. 200 . 2 00 . 2 00 . 2 00. 2 00 . 2 00 . 2 0 4 . 1 . 2 . 3 在普通坐标纸上, 以溶血度为横坐标, 1 / 2 0 稀释补体的用量为纵坐标, 绘制曲线。 找出 5 0 %溶
10、血的补体用量, 作为 1 个单位补体。本试验用 3 个单位补体, 补体效价的计算见附录A。 4 . 1 . 3 溶血素效价的测定 4 . 1 . 3 . 1 稀释溶血素 取 0 . 2 m L溶血素原液, 加人到 1 9 . 8 m L生理盐水中, 制成 1, 1 0 0 稀释的溶血素, 再按表3稀释成 不同稀释倍数的溶血素。 表 3 溶血素的稀释 稀释液溶血素量/ mL 生理盐水/ mL 1 :5 0 0 1 :7 0 0 1 :8 0 0 1 :9 0 0 1 :1 0 0 0 I : 1 2 0 0 1 . 1 4 0 0 1 :1 6 0 0 1: 1 0 0 溶血素1 . 0 1:
11、1 0 0 溶血素1 . 0 1: 1 0 0 溶血素1 . 0 1: 1 0 0 溶血素1 . 0 1: 1 0 0 溶血家z . 0 1: 1 0 0 溶血素0 . 5 1: 1 0 0 溶血素0 . 5 1: 1 0 0 溶血素0 . 5 4 . 0 6 . 0 7 . 0 8 . 0 1 8 . 0 5 . 5 6 . 5 7 . 5 s x/ T 1 0 8 9 -2 0 0 2 表 3 ( 完) 稀释液 溶血素量/ . L生理盐水/ m L 1 , 1 8 0 0 1+2 0 0 0 1 :2 2 0 0 1 :2 5 0 0 1 :2 8 0 0 1 :3 0 0 0 1 :4
12、0 0 0 1 :5 0 0 0 1 :1 0 0溶血素0 . 5 1 ,1 0 0溶血家0 . 5 1, 1 0 0 0 溶血素2 . 0 1: 1 0 0 0 溶血素2 . 0 1: 1 0 0 0 溶血索2 . 0 1: 1 0 0 0 溶血素1 . 0 1: 1 0 0 0 溶血素1 . 0 1, 1 0 0 0 溶血素1 . 0 8 . 5 9 . 5 2 . 4 3 . 0 3 . 6 2 . 0 3 . 0 4 . 0 注: 如果溶血素是由等量甘油保存, 则溶血素原液所需量加倍。 并相应减少生理盐水量. 4 . 1 . 3 . 2 制备不同稀释倍数的溶血素致敏红细胞 取 1 6
13、个试管, 每管加 1 . 5 m L 3 %的红细胞悬液, 然后分别缓慢加人不同稀释倍数的溶血素 1 . 5 m1 _ . 混匀 , 3 T C水浴箱中感 作 1 5 mi n, 4 . 1 . 3 . 3 按附录B所需量配制 1 / 2 。 稀释的补体。 4 . 1 . 34 用不同稀释倍数的溶血素致敏红细胞分别做补体效价测定( 结果参考附录 B ) , 4 . 1 . 3 . 5 溶血素效价 的确定 对每一个稀释度的溶血素均找出 5 0 %溶血时 1 / 2 0稀释的补体用量, 并换算成补体原液的用量( 方 法: 5 0 %溶血时1 / 2 0 稀释的补体用量除以2 0 ) . 在普通坐标
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