[商检标准]-SNT 1140-2002 甜菜胞囊线虫检疫鉴定方法.pdf
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1、甜菜胞囊线虫检疫鉴定方法 Methods for quarantine and identification of Heterodera schachtii Schmidt SNT 1140一2002 前 言 本标准的附录B、附录C、附录D和附录E为规范性附录,附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、南京农业大学。 本标准主要起草人:戚龙君、宋绍祚、林茂松。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规定了对甜菜胞囊线虫检疫和鉴定方法。 本标准适用于甜菜及其他藜科和十字花科等植物及植物繁殖材料的根和病土
2、中甜菜胞囊线虫的检疫和鉴定。 2 原理 甜菜胞囊线虫Sugarbeet cyst nematode,学名:Heterodera schachtii Schmidt,1871,属于线虫门(Nemata)、侧尾腺纲(Secernentea)、垫刃 目(Tylenchida)、异皮科(Heteroderidae)、异皮线虫属(Heterodera)。该病原线虫一生中形态多样,由蠕虫状二龄幼虫进入寄主植物根内发育,变 成豆荚状三龄幼虫,此时出现性别分化,三龄雌幼虫发育成近葫芦形四龄早幼虫,四龄雄虫为蠕虫状,四龄雌幼虫再蜕变为雌性成虫,白色的成熟雌 虫与雄虫交配后,蠕虫状的雄虫便死亡,雌虫完全成熟后就叫
3、胞囊,胞囊一般从根表面掉入土中。受害甜菜出现侧根增多,整个根系呈簇须状,严重 缺少功能根,在太阳照射下或干燥土壤中萎蔫。 甜菜胞囊线虫是危害甜菜及其他藜科和十字花科植物(参见附录A)的一种植物寄生性线虫,该病原线虫主要靠寄主植物和病土的移动进行传播。 它的侵染循环、传播途径、寄主范围、生物学和形态学特征是该检疫鉴定方法的依据。 3 仪器、用具 3.1 Fenwick胞囊漂浮器。 3.2 生物显微镜(100倍1 000倍,具有目镜测微尺或者绘图仪、监视器等)。 3.3 体视显微镜(10倍90倍,具透射光源)。 3.4 加热板。 3.5 低速离心机(1 000 rmin4 000 rmin)。 3
4、.6 离心管(100 mL)。 3.7 载玻片。 3.8 盖玻片。 3.9 分样筛(直径均为20 cm,孔径为20目、60目、100目、300目、500目)。 3.10 烧杯(500 mL、1 000 mL)。 3.11 毛刷。 3.12 打孔器。 3.13 干燥器。 3.14 挑针。 3.15 冰箱。 3.16 滤纸。 3.17 酒精灯。 3.18 培养皿。 3.19 解剖刀。 3.20 搪瓷盘。 3.21 竹针。 3.22 试管。 3.23 记号笔。 3.24 指形管。 3.25 玻璃纤维丝(3 mm5 mm)。 4 药品 4.1 中性树胶。 4.2 TAF固定液(40甲醛7 mL、三乙醇
5、胺2 mL和蒸馏水91 mL混合而成)。 4.3 酒精(浓度为70、95和100)。 4.4 双氧水(H2O2)(浓度为40)。 4.5 丁香油。 4.6 蔗糖溶液(WV为80)。 4.7 指甲油。 4.8 石蜡。 4.9 乳酚油(苯酚20 mL、乳酸20 mL、甘油40 mL和蒸馏水20 mL混合而成)。 5 现场检疫 5.1 抽样 5.1.1 抽样方法 棋盘式、五点式或随机抽样。 5.1.2抽样数量 按总件数的520抽样,最低抽检数量不少于10件或500株。取样的数量为:50株以下取五株;51株200株取10株;201株1 000株取15 株;1 001株5 000株取20株;5 001株
6、以上,每增加5 000株增取五株,不足5 000株的余量计取五株样品。 5.2外观症状检查 对植物,尤其是甜菜、藜科、十字花科及其他植物繁殖材料的带根和土的情况进行检查,注意检查侧根较多,整个根系呈簇须状,植株出现萎蔫 状的材料,收集上述材料和所扦取的样品及运输工具上可能携带的土壤,一并带回实验室检验。 6 实验窒检验 6.1 土壤的收集 用毛刷将收集的材料和所扦取的样品的根或其他组织表面附着的土刷下,收集到塑料袋中,作为检验的土样。 6.2 线虫分离 6.2.1 改进的浮力离心法 本法可以分离到土壤中的胞囊和幼虫,一般用于检验100 g以下的土壤。具体分离步骤如下: 6.2.1.1 搓碎土样
7、,充分混匀。 6.2.1.2 100 mL离心管加水70 mL,再加土样,搅拌成悬浮状。 6.2.1.3 3 000 rmin离心5 min,去上清液。 6.2.1.4 加入80蔗糖液60 mL,搅拌成悬浮状。 6.2.1.5 2 000 rmin离心2 min。 6.2.1.6 上清液倒入套筛中(20目+100目+500目),用清水尽快冲洗。 6.2.1.7 去除20目筛中的杂质;从100目筛中可以收集到胞囊(阴门锥制作方法见附录B);将500目筛中剩余物全部洗入培养皿中,在体视显微镜下观 察,用挑针挑取二龄幼虫制备临时玻片(线虫玻片制作见附录C)镜检。 6.2.2 套筛法 本法可同时分离土
8、壤中的胞囊和二龄幼虫,一般用于检验100 g以下的土壤。具体方法如下: 6.2.2.1 选用20目、60目、100目、300目、500目筛子各一个,从上到下依次放置在特制的架子上; 6.2.2.2 采回的土样放于烧杯中,加水充分搅拌成悬浮状; 6.2.2.3 将土壤悬浮液缓慢倒入套筛中,并用清水冲洗; 6.2.2.4 从60目和100目筛中收集胞囊,从300目和500目筛中收集二龄幼虫,制片镜检。 6.2.3 Fenwick胞囊漂浮器分离法(见图D.1) 仅用于分离土样中的胞囊,一般用于检验100 g以上的土壤。具体方法如下: 6.2.3.1 将收集到的附着土壤铺于干净的浅瓷盘内,将土样在室内
9、风干,去除土壤中的植物组织和粗砂等杂物,称100 g土样备用。 6.2.3.2 先将漂浮器加满清水,再取100 g的风干土样放入漂浮器的上筛中,加水冲洗,使土样全部被淋洗至漂浮筒内。 6.2.3.3 再由上筛加水至漂浮筒内,用100目筛子(底筛)接收从漂浮器中漂浮出来的胞囊和杂物。 6.2.3.4 将100目筛子上的含胞囊的残留物冲洗到滤纸上,在体视显微镜下用毛刷挑取胞囊制片镜检。 7 形态鉴定特征 7.1 异皮线虫属形态鉴定特征 雌虫:有胞囊期;虫体球形或柠檬形,有短颈和末端锥;角质层厚,表面有网状花纹,D层不明显;阴门位于末端,阴门层不突出,阴门区有双 半膜孔或双膜孔,无肛区膜孔,一般有下
10、桥,泡囊有或无(胞囊线虫雌虫阴门锥见图E1)。卵存留在体内,有时也产生卵块,卵表面光滑。 雄虫:虫体蠕虫形、弯曲,侧线四条(偶尔三条);交合刺长于30m,远末端尖或呈叉状,泄殖腔层不形成泄殖腔管;尾圆、非常短。 二龄幼虫:口针短于30m,侧线四条(偶尔三条),食道腺充满体腔;尾圆锥形、端尖,尾的透明后部长度有变化,一般为尾长的二分之一;侧尾 腺口呈刻点状。 7.2 甜菜胞囊线虫形态鉴定特征 7.2.1 测计值(据Raski,1950) 表1 甜菜胞囊线虫测计值 体长m 体宽m 口针 长m 表皮 厚/m 食道 长m 交合刺 长 m 引带 长m a 虫体环纹 间距m 雌虫 626890 36149
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