[商检标准]-SNT 1151.4-2003 对虾黄头病毒(YHV)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法.pdf
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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 1 5 1 . 4 -2 0 0 3 对虾黄头病毒( Y H v ) 逆转录 聚合酶链式反应( R T - P C R ) 检测方法 P r o t o c o l o f r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( R T - P C R ) f o r y e l l o w h e a d v i r u s o f s h r i m p ( Y H V ) 2 0 0 3 - 0 5 - 2
2、 8 发布2 0 0 3 - 1 2 - 0 1实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监督 检 验 检疫 总 局 发 布 S N / T 1 1 5 1 . 4 -2 0 0 3 .岛 召. 月 月 q青 本标准的附录A是规 范性附录, 附录s 是资 料性附录。 本 标准由国家 认证认可监 督管理委员 会提出 并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 刘左、 史秀杰、 高隆英、 江育林。 本标准系 首次发布的 检验检疫行业标准。 S N/ T 1 1 51 .4 -2 0 0 3 对虾黄头病毒( YH V ) 逆转录 聚合酶链式反应( R T - P
3、 C R ) 检测方法 1 范围 本标准规定了用逆转录聚合酶链式反应技术检测对虾黄头病毒的方法。 本标准 适用于 对虾黄头病毒的 鉴定及其流行病学调查、 诊断、 检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件, 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件, 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法( e q v I S O 3 6 9 6 : 1 9
4、8 7 ) 3试荆和材料 3.1 3. 2 3. 3 3. 4 3. 5 3. 6 3. 7 3. 8 3. 9 24 2 4 4.1 4. 2 4. 3 4. 4 4. 5 4. 6 4. 7 4. 8 4. 9 水: 应符合 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2中一级水的规格。 T a q 酶: -2 0 保存, 不要反复冻融或温度剧烈变化。 逆转录酶AMV: -2 0 保存, 不要反复冻融或温度剧烈变化. 核糖核酸酶抑制剂( R N a s in ) : 一2 0 保存, 不要反复冻融或温度剧烈变化。 d N T P ( 含d C T P , d G T P , d A T
5、P , d T T P各 1 0 m mo l / L ) , 引物: 浓度为 4 0 k mo l / L 。其序列如下: 上游引物 1 0 F : 5 - C C G C T A A T TT C A AA A AC T AC G - 3 下游引物 1 4 4 R: 5 - AA G G T G T T AT G T C G AG G A A G T - 3 异丙醉: 分析纯, 使用前预 冷到一 2 0 0 C , 矿物油: 要求无 D N A酶和 R N A酶。 标准分子量: 推荐使用p U C 1 9 D N A / M s p I H p a II ) , 各片段大小依次为5 0 1
6、 b p , 4 0 4 6 p , 3 3 1 b p , 6 p , 1 9 0 6 p , 1 4 7 b p o 器材和设备 P C R扩增仪。 电泳仪。 微量移液器及吸头。 紫外观察灯。 恒温培养箱。 普通冰箱和低温冰箱。 电动匀浆器。 离心机和离心管。 制 冰机。 取样和 制样 5 . 1 取样 S N/ T 1 1 5 1 . 4 -2 0 0 3 5 . 1 . 1 取新鲜的 对虾组织作为祥品。 处理前要将样品 放在冰上。 如果2 h 以后才能处理, 宜 将样品保 存在无 水乙醇中, 无水乙 醇体积是样品体积的1 0 倍以上, 可放置在室温下保存4 个月。血淋巴 样品需 保存在
7、一7 0 r , 5 . 1 . 2 对于仔虾或稚虾, 取整只虾或虾头作样品。取虾头时, 用灭菌剪刀和 镊子去除眼睛、 头胸甲、 所 有的胸部附器和头部以后的腹部。 5 . 1 . 3 对于成虾, 取鳃丝、 淋巴器官或血淋巴作为样品. 5 . 1 . 3 . 1 取鳃丝时, 用灭菌剪刀剪去头部两 侧的 头胸甲, 露出鳃丝, 然后用剪刀剪取鳃丝。 5 . 1 . 3 . 2 取淋巴器官时, 要除 去头 部以 后的 腹部, 并切除头胸甲 前方的嚎部。 从头 胸甲中 间, 将头 胸部 分为两 部分, 暴露出内 部的组织器官。 在胃 的腹侧、 肝胰腺的 后面, 取出白 色、 呈二裂片状的淋巴 器官.
8、5 . 1 . 3 . 3 取血淋巴时, 先用1 m L针管吸取5 0 0 p L 1 0 %的柠檬酸盐溶液( 见附录A中第A . 1 章) , 然 后在针管前插上一个 2 6号的针头。抓住对虾, 使腹部朝上将针头水平地插人第一和第二对游泳足之 间, 并一直插到最后一对胸部附器的凹陷处。缓慢吸取血淋巴。 5 . 2制样 在 1 5 下, 在 1 . 5 m L P C R管中首先加人 2 5 mg -1 0 0 mg 组织或 2 0 0 I. L血淋巴柠檬酸盐混合液, 再加人1 5 0 p L C T A B 溶液( 见附录A中 第A . 2 章) , 用小剪刀剪碎, 然后用均浆器将样品 均浆
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