αSYNUCLEIN基因过度表达诱导HEK293细胞αSYNUCLEIN蛋白病理性积聚.pdf
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1、 论著 -synuclein 基因过度表达诱导 HEK293 细胞 -synuclein 蛋白病理性积聚 陈涛唐北沙廖小平严新翔张如旭张玉虎汤建光曹立郭纪锋李静 【摘要】 目的观察-synuclein 过度表达诱导 HEK293 细胞-synuclein 蛋白病理性积聚的作用。方法 将消除终止密码子-synuclein 基因扩增产物连入 pGEM T-easy 载体, DNA 测序证实后亚克隆入增强型绿色 荧光蛋白 pEGFP-N1 质粒, 通过限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。采用脂质 2000 将野生型-synuclein-EGFP 真核表达载体转染 HEK293 细胞, 48 h 后采用 A
2、xiovert200 型倒置荧光显微镜、 荧光免疫细胞化学观察其在 细胞内的表达, HE 染色观察细胞胞浆内嗜酸性小体的形成。结果消除终止密码子的扩增序列经测序证 实并亚克隆入 pEGFP-N1 质粒后, 限制性内切酶酶切鉴定质粒大小、 酶切位点上均符合实验设计。将野生 型-synuclein-EGFP 真核表达载体转染 HEK293 细胞, 48 h 后荧光显微镜下观察细胞在波长 488nm 蓝色激发 光下发出明亮的绿色荧光, 其中某些细胞出现绿色荧光物质积聚; 免疫荧光细胞化学检测,EGFP 阳性细胞 同时也表现为 a-synuclein 免疫反应阳性, 某些细胞胞浆内可见-synucle
3、in 免疫阳性产物聚集; HE 结果发现 一些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体形成, 约占细胞总数的 10.8%。结论野生型-synuclein 基因过表 达可诱导-synuclein 蛋白在 HEK293 细胞内积聚, 胞浆内嗜酸性小体形成。 【关键词】-synuclein 基因; 蛋白积聚; 帕金森病 The wild-type-synuclein over-expression to induce the protein aberrant aggregation of-synuclein in HEK293 cells in vitro*CHEN Tao1,TANG Bei-sha1,LI
4、AO Xiao-ping2,YAN Xin-xiang1,ZHANG Ru-xu1, ZHANG Yu-hu1, TANG Jian-guang1,CAO Li1, GUO Ji-feng1,LI Jing1. 1 (Department of Neurology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan,410008 P . R . China) ; 2 (Department of Neurology,Hainan Provincial People s Hospi- tal, Haikou, Hainan,
5、571300 P . R . China) Corresponding author: TANG Bei-sha, Email: bstang7398yahoo . com . cn 【Abstract】 ObjectiveTo investigate over-expression of wild-type-synuclein inducing the aberrant aggregation of-synuclein in HEK293 cell in vitro . MethodsThe cDNA encoding the human-synuclein without the stop
6、 code was cloned into PGEM T-easy vector. Using enzyme map and DNA sequencing analyzed and determined the recombinant plas- mid,and then sub-clone the-synuclein cDNA fragment into pEGFP-N1 vector. The recombinant plasmids-synuclein- pEGFP were transfected into HEK293 cells by lipofectamin 2000. The
7、aberrant aggregation of-synuclein was measured by EGFP fluorescence,anti-synuclein immunocytochemistry. The inclusions in the cultured cells were identified with HE staining. ResultsThe restriction enzyme map suggested that eukaryotic expression vector for human wild-type- synuclein gene was constru
8、cted successfully. By EGFP fluorescence,anti-synuclein immunocytochemistry,it could be observed that the-synuclein protein could aggregate in cytoplasm and the Lewy body-like inclusions found in cytoplasm of cultured cells. ConclusionThe over-expression of wild-type-synuclein can induce protein aber
9、rant aggregation and Lewy body-like inclusions formation in cytoplasm of HEK293 cell in vitro . 【Key words】-synuclein gene; aggregation; Parkinson disease *SupportedbytheNational “ 863 ” High-TechnologyResearchandDevelopmentProgramGrant( 2004AA227040, 2002BA711A07) ,the National“Tenth Five-Year”Scie
10、nce and Technology Program Grant (2004BA720A03) , the National Natural Sci- ence Foundation of China (Proj.No.30370515)and the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education (RFDP)(Proj. No. 20020533024) 基金项目: 国家 863 高科技研究发展计划项目 (2004AA227040, 2002BA711A07) 、“十五” 国家科技攻关计划项目 (2004BA720A03
11、) 、 国家自然科学基 金项目 (30370515) 、 高等学校博士学科点专项科研基金项目 (20020533024) 作者单位: 410008 长沙, 中南大学附属湘雅医院神经内科 陈涛(现在海南省人民医院神经内科) 、 唐北沙、 严新翔、 张如旭、 张玉虎、 汤建光、 曹 立、 郭纪锋、 李静 ; 海南省人民医院神经内科 (廖小平) 通信作者: 唐北沙, Email: bstang7398 91中华医学遗传学杂志 2006 年 2 月第 23 卷第 1 期Chin J Med Genet,February 2006,Vol. 23,No. 1 -synuclein 蛋白是由 Marot
12、eaux 等 1于 1988 年从 电鲟鱼 (Torpedo) 的带电器官中首先分离出来的一种突 触前末梢蛋白。1990 年 Nakajo 等 2首次从阿尔茨海 默病 (Alzheimer s disease,AD) 患者脑内的淀粉样斑块 中分离纯化成功。它是由 140 个氨基酸残基组成的一 种酸性蛋白, 分子量为 14460 u, 包括 3 个相互分离的 区域:(1) 氨基末端: 含 1 60 个残基, 含有一个高度保 守的六聚物序列(KTKEGV) ,可与脂质双分子层结 合;(2) 中央部分: 含 61 95 个残基, 构成高度淀粉源 性的非-淀粉样肽 (NAC) , 具有强的疏水性;(3
13、) 羧基 末端: 含 96 140 个残基, 由丰富的酸性氨基酸组成, 具有强的亲水性。研究证实, -synuclein 蛋白是 Lewy 小体的主要组成部分 3, 温度、 pH 值、 翻译后的修饰与 配体结合等均可使-synuclein 蛋白构象发生变化导致 病理性聚集及 Lewy 小体形成 4。 目前国内有关-synuclein 过表达的研究已在 SH- SY5Y、 PC12 两种细胞模型中开展 5, 6, 但尚无 HEK293 细胞模型的研究。为观察-synuclein 过表达在不同细 胞系的神经毒性, 我们应用脂质体转染法将构建成功 的人-synuclein-pEGFP 的 真 核 细
14、 胞 表 达 载 体 导 入 HEK293 细胞, 建立-synuclein 转基因细胞模型, 观察 -synuclein 过表达导致-synuclein 蛋白病理性积聚的 作用, 为进一步探讨-synuclein 在帕金森病发病机制 中的作用提供依据。 1材料与方法 1.1 -synuclein-pEGFP 载体的构建 根据 GenBank 提 供的-synuclein 完整的 CDS 序列, 消除终止密码子, 用 DNAstar 软件设计特异性引物, 序列为: 上游 5-ggAA- gATCTACCATgg ATggATgTATTCATgAAAggACTT-3 下 游 5-ggCCTTAA
15、 gggCTTCAggTTCgTAgTCTTg-3。以人胎脑 cDNA 文库 (中国医学遗传学国家重点实验室) 为模板, 用 Pyrobest 酶 (美国 Clontech) 进行 PCR 扩增。加 “A” 、 回收后连入 pGEM-Teasy 载体, 转化 JM109 感受态细菌 (中国医学遗传学国家重点实验室) , 按照 QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol (美国 Invitrogen) 抽取并纯化质粒, 测序证实。用核酸内切酶 EcoR/ Bgl, 对-synucle- in-pGEM 质粒和 pEGFP-N1 质粒双酶切, -synuclein 片 段
16、与 pEGFP-N1 质粒片段双胶连转化宿主菌 JM109, 重 组质粒-synuclein-pEGFP 应用 EcoR/ Bgl双酶切 鉴定, 将重组质粒严格按照 Lipofectamine 2000 Protocol (美国 Invitrogen) 说明书进行转染。 1.2EK293 细胞复苏、 培 养 和 传 代复 苏 人 胚 肾 HEK293 细胞 (中国医学遗传学国家重点实验室) , 置入 25 cm2的培养瓶, 用含 15%FBS 的 RPMI1640 (Sigma) 培 养基在 37、 5%CO2的培养箱中培养, 显微镜下观察 细胞汇合度达 95% 100%, 以 1:3 传代。
17、转染前 24 h 将细胞以每孔 1 105个细胞接种 12 孔培养板 (培养 孔预先置入盖玻片) , 细胞汇合度达 80% 左右时准备 进行细胞转染。 1.3转染严格按照 Lipofectamine 2000 Protocol (Invit- rogen) 说明书进行转染。用不含 FBS 的 RPMI1640 培 养基洗涤细胞两次, 加入含 4L Lipofectamine 2000 及 1.6g 质粒 DNA、 不含 FBS 的 RPMI1640 培养基 1 mL 在 37、 5%CO2的培养箱中孵育 6 h, 改用含 15% FBS 的 RPMI1640 继续孵育 48 h。 1.4检测-
18、synuclein 过表达诱导细胞-synuclein 蛋白 病理性积聚 1.4.1细胞形态观察及报告基因 EGFP 表达检测 采用 Axiovert200 型倒置荧光显微镜, 观察细胞形态, 并 在 488nm 蓝色激发光下观察报告基因 EGFP 发出的绿 色荧光。 1.4.2 -synuclein 免疫荧光细胞化学检测 取加有盖 玻片的 12 孔培养板细胞, 用预冷的 PBS 漂洗 1 次, 加 入 - 20 预冷甲醇 500L,- 20 固定 20 min, 加入 0.1% tritonX-100 300L 室温静置 10 min,PBS 摇床洗 3 次, 每次 5 min, 5% BS
19、A 摇床上封闭 30 min, 加入鼠 抗人-synuclein 一抗 (1:100, Sigma) 50L 摇床上孵育 1 h, PBS 摇床洗 3 次, 每次 5 min, 5% BSA 摇床上封闭 30 min, 加入山羊抗鼠 Cy3 多克隆抗体 (1:50, Sigma) 50L 摇床上孵育 40 min, PBS 摇床洗 6 次, 单蒸水洗 1 次, 50%甘油封片, Axiovert200 型倒置荧光显微镜下观察、 照相。 1.4.3HE 染色取培养细胞, 用预冷的 PBS 洗 3 次, 用预冷的 95%酒精 - 20固定 15 min, PBS 洗 2 次 1 min, 加入苏木
20、精染液 250L, 室温静置 10 min, 自来水 浸洗 30 min 稀盐酸酒精分色数秒, 自来水浸洗, 淡氨 水使胞核蓝化, 自来水浸洗, 加入伊红染液 300L, 室 温静置 10 min, 自来水浸洗, 70%、 80%、 90%、 95% 酒 精各脱水 1 min, 100% 酒精脱水 3 min, 二甲苯透明 1 min, 100% 甘油封片, Leica 倒置显微镜观察、 照相, 在 10 倍物镜下随机选择 10 个视野, 分别进行细胞总数 及细胞胞浆内出现嗜酸性小体细胞计数, 计算阳性细 胞比率。 2结果 2.1 -synuclein-pGEM 测序结果 用 QIAprep
21、Spin 柱 抽提质粒后在 ABI 3100 型测序仪测序, 并用 DNAstar 软件将测序结果与标准序列进行对比, 结果显示: 消除 终止密码子的扩增序列与-synuclein 有 100% 的同源 02中华医学遗传学杂志 2006 年 2 月第 23 卷第 1 期Chin J Med Genet,February 2006,Vol. 23,No. 1 性。 2.2 -synuclein-pEGFP 真核细胞表达载体酶切鉴定结 果限制酶切图谱显示: -synuclein-pEGFP 融合载体 经 EcoR/ Bgl双酶切后均变成两条带, 提示构建的 载体在质粒大小、 酶切位点上均符合实验设
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