β防御素2融合VECADHERIN重组质粒的抗血管生成免疫作用.pdf
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1、防御素2融合V E - C a d h e r i n重组质粒的 抗血管生成免疫作用* 王国庆,王永生,王瑞,吴杨,杜小波,徐建容,刁鹏 四川大学华西医院 生物治疗国家重点实验室 肿瘤中心(成都6 1 0 0 4 1 ) 【摘要】 目的构建防御素2 ( B D 2 )融合血管内皮钙粘附素( VE - C a d h e r i n )胞外段重组质粒,以期探讨其免 疫后抗肿瘤血管生成作用。方法 P C R扩增成熟B D 2片段和VE - C a d h e r i n胞外段。以连接肽连接成熟B D 2片段 和VE - C a d h e r i n胞外段,通过重叠P C R构建融合分子。将所得三
2、种片段插入到p S e c T a g 2 B真核表达质粒。转染 C T2 6肿瘤细胞, R T- P C R检测其表达。取转染 C OS细胞后的上清液做趋化实验,检测融合分子对树突状细胞 ( D C )的趋化作用。所得质粒经肌肉注射免疫小鼠后,皮下植入包裹C T2 6肿瘤细胞的藻酸盐微球,检测血管生成情 况。结果测序证实三种质粒构建正确,能在真核细胞中顺利表达。B D 2融合重组质粒和未融合的B D 2质粒转染 细胞后的上清液趋化D C的能力相近( P0 . 0 5 ) 。与其余各组质粒免疫相比,融合重组质粒免疫后能够显著抑制藻 酸盐微球中肿瘤细胞诱导的血管生成( P0 0 5 ) T h
3、e a l g i n a t e b e a d a s s a y r e v e a l e d t h a tt h e t u mo r - i n d u c e d a n g i o g e n e s i s i n f u s i o n p l a s mi d i mmu n i z e d mi c e wa s s i g n i f i c a n t l ys u p p r e s s e dwh e nc o mp a r e dwi t ht h a ti nn o n f u s i o np l a s mi d( P0 . 0 5 ) ,与L i p
4、 o组, p S e c组以及C a d组相比差 异有统计学意义( P0 . 0 1 ) ,如图5 。趋化实验的结 果证实D e f - C a d重组质粒在真核细胞表达后仍具有 B D 2趋化D C的活性。 2 . 5 融合重组质粒免疫对血管生成的作用 本实验采用各组质粒免疫4次后的B AL B / c小 图5质粒转染C O S 7细胞培养上清液对D C细胞的趋化作用 F i g5 C h e mo t a x i sa s s a yo fp r o d u c t e x p r e s s e db yf u s i o np l a s mi di n C O S 7c e l l
5、s * P 0 . 0 5 ,v sL i p o ,p S e ca n dc a dp l a s mi d 鼠,于皮下植入藻酸盐包裹的 C T2 6细胞( 2 1 0 4 个/粒) , 1 2d后取出藻酸盐颗粒,在解剖显微镜下 观察发现, D e f - C a d质粒免疫组藻酸盐颗粒表面新 生血管明显少于其余各组。 F I T C - D e x t r a n摄取实验 显 示, D e f - C a d质 粒 免 疫 组 藻 酸 盐 颗 粒 对 F I T C - D e x t r a n的摄取率明显低于其余各组( P0 . 0 1 ) , 仅 为单纯脂质体组的2 2 %(附表)
6、 。 附表质粒免疫对藻酸盐包裹C T 2 6肿瘤细胞诱导的血管生成的影 响 T a b l e E f f e c t o f D N Av a c c i n eo na n g i o g e n e s i s o f C T 2 6t u mo ri nt h e a l g i n a t emo d e l G r o u pnD e x t r a n( g ) T r e a t me n t / c o n t r o l ( %) C o n t r o l52 . 7 0 . 51 0 0 p S e c52 . 8 0 . 41 0 4 D e f52 . 6 0 .
7、29 6 C a d52 . 5 0 . 39 3 D e f - C a d50 . 6 0 . 3 * 2 2 * P 0 . 0 1 ,v sc o n t r o l 3 讨论 实体肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管生成。 抗肿瘤血管生成是目前肿瘤治疗研究中的热点。利 用肿瘤新生血管特异或高表达的一些分子,发展特 异的免疫治疗,可以起到靶向性地破坏肿瘤的血管 供应,从而抑制肿瘤生长的作用 7 。 发展针对肿瘤新生血管相关分子的单克隆抗体 治疗是一种很好的思路,但是存在着生产工艺复杂, 成本较高,作用途径单一的缺点。如果能激发机体对 肿瘤新生血管相关分子的主动免疫,通过利用体液 免疫和细胞免
8、疫两种途径,有可能产生更强的杀伤 肿瘤血管内皮细胞的作用。并且可大大降低药物生 产成本。 743JS i c h u a nUn i v( Me dS c i E d i )Vo l . 3 7No = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = . 32 0 0 6 但是机体对肿瘤新生血管相关分子存在着免疫 耐受。目前基于肿瘤新生血管相关分子免疫治疗的 方法其基本思想就是通过种种
9、手段打破免疫耐受。 例如:以肿瘤新生血管相关分子体外冲击D C后免 疫动物 8 ;口服细菌为载体的肿瘤新生血管相关分 子疫苗 9 ;本实验室发展的肿瘤新生血管相关分子 异种免疫 1 0 等。体外冲击D C需要多次分离D C ,操 作繁琐,临床应用有一定难度;口服细菌载体存在生 物安全方面的担忧;异种免疫需要充分考虑分子之 间的同源性。因此有必要设计一种具有普遍性,易于 操作的,安全 性高的抗血管 生 成 免 疫 治 疗 策 略。 D NA疫苗是比较好的选择。 天然免疫和获得性免疫并不是孤立的,作为天 然免疫的重要分子, B D 2具有趋化D C ,促进D C成 熟的作用,而D C是功能最强大的
10、抗原提呈细胞。目 前的研究证实防御素具有连接天然免疫和获得性免 疫的桥梁作用 1 1 。我们通过重叠P C R的办法顺利 地将mMB D 2和e xVE - C a d h e r i n融合,并在两个片 段之间引入了连接肽,以保证不损害两个蛋白原有 的特性。通过测序证实成功构建了融合mMB D 2和 e xVE - C a d h e r i n胞外段的新分子, R T- P C R验证了 该融合分子能顺利地表达。融合重组质粒转染真核 细胞后分泌的上清对D C有趋化作用,其趋化能力 与未融合的mMB D 2相近。融合重组质粒对小鼠免 疫后能够抑制皮下藻酸盐微球中新生血管形成。以 上实验结果说
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