αLTX及αLTXN4C通过不同机制促进胰腺β细胞CA2I升高.pdf
《αLTX及αLTXN4C通过不同机制促进胰腺β细胞CA2I升高.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《αLTX及αLTXN4C通过不同机制促进胰腺β细胞CA2I升高.pdf(6页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、 第 51 卷 第 1 期 2006 年 1 月 论 文 44 -LTX 及 -LTXN4C通过不同机制促进 胰腺 细胞Ca2+i升高 酒亚明 * 胡志涛* 刘 杰* 吴政星 徐 涛 ( 华中科技大学生命科学与技术学院, 生物物理与生物化学研究所, 武汉 430074; 中国科学院生物物理研究所生物大分子国家 实验室, 北京 100101. * 同等贡献. 联系人, E-mail: ; ) 摘要 -LTX 是一种从黑寡妇蜘蛛毒腺中提取的神经毒素, 它通过和受体的结合, 可以有效地触发神 经末梢突触前囊泡的释放. -LTXN4C是一种研究-LTX 同 CIRL受体作用的有效工具. 通过对大鼠胰
2、腺 细胞的研究, 发现-LTX 通过在细胞膜上的穿孔引发外钙的内流使Ca2+i升高, 而-LTXN4C是通过引 起胞内钙库 Ca2+的释放导致Ca2+i升高, 并且-LTXN4C的作用依赖于细胞外二价阳离子的存在. 关键词 -latrotoxin -LTXN4C 钙离子 黑寡妇蜘蛛神经毒素-latrotoxin(-LTX)是一 种从黑寡妇蜘蛛毒腺中提取的惟一作用于脊椎动物 的神经毒素, 它通过和细胞膜上特异的高亲和力受 体结合, 可以造成大量的神经递质释放1,2. 通过长 期的研究, 人们已经发现了几种在结构上完全不 相 同 的 -LTX 细 胞 膜表面 受 体 . 最 早 报 道的 是 Ne
3、urexin3,4, 该受体只有在细胞外 Ca2+存在的时候 才可以和-LTX结合. 后来人们又发现-LTX在没有 外 Ca2+存在时也可以发挥作用, 这就导致了非钙依 赖性受体(calcium independent receptors of -latro- toxin, CIRL)也称为 Latrophilin5,6的发现. CIRL 是一 种有着 7个跨膜区的蛋白质, 属于 G 蛋白偶联受体的 分泌素/钙调素受体家族7. 最近, 人们还发现了一个 新的-LTX 受体蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP), 该受体 同毒素的作用也是非钙依赖性的8. 但是有研究表明, PTP对-LTX 的功能只是起着
4、次要的作用. 虽然人们很早就认识到在有二价阳离子(Ca2+或 Mg2+)存在的情况下, -LTX可以形成二聚体, 然后进 一步形成四聚体, 从而在细胞膜上形成对 Ca2+通透 的孔道9,10. 然而, 在触发细胞分泌的机制上, 毒素 并不是仅仅通过对 Ca2+通透的孔道起作用. 有研究 表明, 在没有外 Ca2+存在的情况下, -LTX 仍然可以 触发细胞分泌. 这也就意味着, 在-LTX 的作用中, 存在着一种非 Ca2+依赖的方式11, 这种结果归于受 体介导的信号通路的作用. 有些实验表明, 毒素和 CIRL 的结合会激活磷脂酶 C(phospholipase C, PLC) 从而导致
5、IP3的生成, 促使 Ca2+从胞内钙库中释放出 来1214. 因而有人认为在-LTX 的作用中, 细胞内 Ca2+的释放起到了一个关键性的作用14,15, 但是这种 理论并不能解释由-LTX 引起的所有现象. 在-LTX 受体介导的信号通路研究中, 由于 -LTX 可以在细胞膜上形成穿孔, 外钙内流导致的 各种强烈效应往往使信号转导研究受到影响. 突变 毒素-LTXN4C可以很好的解决这个问题, 虽然它与 受体的亲合力与野生型相同, 但是它不能在膜上形 成穿孔. 在功能上, -LTXN4C和-LTX 一样, 也可以 促发神经递质的释放12,16, 为对毒素的受体介导的 信号通路研究提供了一个
6、很好的材料. 本文针对 -LTX 及其突变体-LTXN4C对细胞的细胞内钙影 响进行了比较研究. 1 材料与方法 () 溶液配制. 参照娄雪林等人17的方法配制 标准 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液(KRBB), 无 Ca2+, Mg2+的 KRBB 缓冲液. 细胞培养基为添加有 10%(体 积比)的灭活胎牛血清的 DMEM (Dulbeccos modified Eagles medium). 标准细胞外液含(mmol/L): NaCl, 150; KCl, 2.8; MgCl26H2O, 2; CaCl22H2O, 2.6; 葡萄 糖糖, 3; HEPES, 10. 标准细胞外液
7、去除 CaCl2, 加入 1 mmol/L EGTA则得到无Ca2+细胞外液, 在此基础上 把外液中的MgCl2用 NaCl取代, 则得到无 Ca2+, Mg2+ 的细胞外液. 有镧外液则是在标准细胞外液中加入 2 mmol/L LaCl3, 所有外液的 pH 为 7.4, 渗透压为 310 mOsm. 胎牛血清, BSA, DMEM 为 Gibco 产品; Fura-2/AM 为 Molecular Probe 公司产品, 其他常用试 剂均为 Sigma 公司产品. () 细胞制备及培养. 分离培养单个原代 细 论 文 第 51 卷 第 1 期 2006 年 1 月 45 胞的基本方法参见
8、文献17. 将 Wistar 大鼠的胰腺组 织取出, 使用 V型胶原酶(Collagenase V)使胰岛散开, 再通过 Dispase消化出单个的 细胞, 贴壁, 加入培 养基, 在 5% CO2的恒温培养箱中培养, 实验中选择 直径为 1214 m 的细胞为实验对象. () Ca2+i显微荧光测量. 将培养24 d的细胞 转至相应的细胞外液中, 加入酯化的钙荧光探针 Fura-2/AM 至终浓度 3 mol/L, 在 37下孵育 20 min. 在 Zeiss Axiovert 100 荧光显微镜上配置的 TILLCa2+ 测量系统可接收细胞内 fura-2 受 340 和 380 nm
9、紫外 光 激 发 的 荧 光 信 号F340 和F380. 荧 光 比 率 (F340/F380)可反映Ca2+i的相对变化. 采样频率为 1 Hz, 实验在(302)下进行. () 膜电容测量. 采用 EPC-9 膜片钳放大器和 PULSE + LOCK-IN 软件(Heka Electronics Lambrecht, 德国)记录和分析静息时和加-LTX 处理后的 细胞 的膜电容变化. 实验中所使用的电极电阻值为 35 M, 细胞钳制电位为70 mV, 给予频率为 1024 Hz 振幅为 10 mV 的正弦波命令电压刺激以记录细胞膜 电容的变化, 所采集到的信号用 2.9 kHz 滤波,
10、采样 频率为 15 kHz. 实验所用的电极内液为(mmol/L): CsGlu, 125; HEPES, 40; MgATP, 2; Na2GTP, 0.3; MgCl26H2O, 1; EGTA, 0.3 (pH 7.2, 300 mOsm). 膜电 容数据用 IGOR Pro 4.9 (WaveMetrics, Lake Oswego, OR)分析. () 刺激物及其施加. -LTX 购自 Alomone Labs (Cat# L-130, Jerusalem, Israel), -LTXN4C由英国 Yuri Ushkaryov 教 授 (Department of Biochemis
11、try, Imperial College, London, UK)赠送. 在电极拉制器 (Narishige, 日本)上拉制出孔径约 5 m 的玻璃微滴 管, 以相应的细胞外液将毒素的浓度调至 3 nmol/L 后, 充灌到微滴管内. 刺激时, 将此加药微管迅速移 至距所测细胞约 10 m处, 对微管内施加正气压即可 将药液吹出, 加完药后, 立即将加药管撤出. 此种近 距离的加药可使单个细胞完全处于刺激溶液中18. 2 结果 2.1 -LTX 引起Ca2+i的升高依赖于细胞外液中的 Ca2+ 在零钙的外液中, 于 60 s 处给予细胞 3 nmol/L 的-LTX 刺激时, 细胞的荧光比值
12、 F340/F380 没有明 显变化, 表明细胞Ca2+i没有明显变化, 2 min 后进行 图 1 -LTX 引起的Ca2+i 升高依赖于外液中的钙离子 在零钙外液中, -LTX 不能引起Ca2+i 的升高, 但是用正常有钙外液 (2.6 mmol/L)置换以后, -LTX 则可以引起明显的Ca2+i升高(n = 5, P 0.01), *, P0.01 图 2 -LTX 在细胞膜上形成穿孔导致外钙内流从而引 起Ca2+i 升高 在全细胞模式下, 对单个 细胞吹加-LTX, 可以同时记录到打孔所 引起的电流及相应的细胞内钙离子浓度(以 F340/F380 比值表示)的变 化(n = 4) 图
13、 3 -LTX 引起细胞膜电容的增加 -LTX 在细胞膜上打孔, 引起外钙内流, 从而进一步引发钙离子依赖 性的分泌(膜电容的增加). 膜电容的平均增加量为 1.6 0.4 pF (n = 6, P 0.05). 实验选用全细胞模式, 钳制电压为70 mV 第 51 卷 第 1 期 2006 年 1 月 论 文 46 外液灌流, 将外液置换成正常外液, 可以看到在大约 90s 以后, 随着时间的延长, 细胞Ca2+i 明显升高 (图 1). 正常外液中, 用全细胞模式(钳制电压为70 mV, 封接电阻为 12 G)可以纪录到由-LTX 引起 的内向电流, 即打孔现象, 并同时纪录到 F340
14、/F380 比率的增加, 表明细胞的Ca2+i 在同步升高. 随着时 间的延长, 打孔增多, F340/F380 比值也增加, 两者之 间有着很好的一致性(图 2). 这表明Ca2+i的升高是 由于外液中 Ca2+的内流造成的. 用膜片钳膜电容测 量方法, 我们也观察到-LTX 引起 细胞明显的钙依 赖性分泌(膜电容的增加)(图 3). 2.2 -LTX 引起的Ca2+i上升可以被 La3+阻断 为了进一步验证上述实验的结果, 我们在正常 外液中加入 2 mmol/L LaCl3, 再给予 3 nmmol/L 的 -LTX 刺激. 可以看到Ca2+i没有明显的变化, 但是 在同一个细胞中, 当
15、将无钙外液置换为正常外液以 后, 由-LTX 造成的Ca2+i上升可以重新恢复. 这表 明-LTX 引发的Ca2+i升高可以被 La3+阻断. 图 4 La3+可以阻断-LTX 在细胞膜上的穿孔 在含有 La3+(2 mmol/L)的正常外液中, 对细胞吹加-LTX, 不能引 起Ca2+i的升高. 但在同一个细胞上, 用无 La3+的外液将其置换以后, -LTX 又可引起明显的Ca2+i升高(n = 5, P 0.01). *, P0.01 2.3 -LTXN4C引起的Ca2+i上升依赖于二价阳离子 -LTXN4C作为一种突变毒素, 它在细胞膜上不 能形成穿孔, 也不会造成 Ca2+的内流,
16、因此它是研究 受体介导的信号通路的很好材料. 在正常外液和无 Ca2+外液中, 加入 3 nmol/L 的-LTXN4C都可以造 成Ca2+i的升高, 而且结果有很强的相似性, 表明 -LTXN4C引发的Ca2+i升高是由于细胞内钙库 Ca2+ 的释放造成的. 这种Ca2+i升高可以较快的恢复到基 值水平(图 5(a)和(b). 为了进一步研究外液中二价阳 离子对-LTXN4C影响, 我们去除外液中的 Ca2+和 Mg2+以后, 再给予-LTXN4C刺激, Ca2+i没有明显变 化, 表明-LTXN4C对Ca2+i的作用需要二价阳离子 的存在. 图 5 -LTXN4C引起胞内钙库Ca2+的释放
17、 (a) 在正常外液中, -LTXN4C可以引起明显的Ca2+i升高, 并且在达 到峰值之后又可以快速的回落至基值水平(n = 6, P 0.001). (b) 与 -LTX 的作用方式不同, -LTXN4C可以在零钙外液中引起Ca2+i的升 高(n = 5, P 0.001). (c) 在零钙零镁的外液中, -LTXN4C完全不能引 起Ca2+i的变化, 表明-LTXN4C的作用依赖于二价阳离子的存在. *, P0.01 论 文 第 51 卷 第 1 期 2006 年 1 月 47 2.4 -LTX 和 -LTXN4C对Ca2+i的影响不同 从前面的结果可以看出, 在无钙外液中, -LTX
18、 和-LTXN4C引发的Ca2+i变化是明显不同的. 为了 进一步验证这个结果, 在 细胞中分别给予-LTX 和 -LTXN4C的 刺 激 , 结 果 表 明 , -LTX 不 能 导 致Ca2+i的变化; 但是在同样的细胞上, 用-LTXN4C 刺激, 可以看到Ca2+i有很明显的上升, 并且可以较 快地恢复至静息水平(图 6(a). 为了进一步验证在 细胞上的结论, 选取 细胞的传代细胞系 INS-1 细胞 重复了同样的实验, 结果表明-LTX 和-LTXN4C在 INS-1 上的作用与在细胞中的作用完全一致(图 6(b). 图 6 -LTX 和-LTXN4C对Ca2+i影响的差异 (a)
19、 在零钙外液中, 在同一个 细胞上先后吹加-LTX 和-LTXN4C, 进一步证实了二者的作用方式是不同的(n = 8, P 0.01). (b) 在 INS-1 细胞上也得到了同样的结果(n = 4, P 0.01). *, P0.01 3 讨论 -LTX 是一种由黑寡妇蜘蛛分泌的神经毒素, 它可以引起神经递质的释放1,19. 在-LTX 不敏感的 PC12 细胞上表达其受体后, 也可以导致细胞对 -LTX 敏感, 表明它的作用依赖于其细胞表面受体 的存在7,20.实验结果表明, 当细胞外液中有 Ca2+存在 时, -LTX 引起Ca2+i升高. 当外液中没有 Ca2+时, -LTX 并 不
20、 能 引 发 Ca2+i的 升 高 . 这 些 结 果 表 明Ca2+i的升高是由外液中的 Ca2+通过毒素在细胞 膜上的穿孔内流造成的. -LTX 形成的穿孔可以被 La3+阻断2123, 产生这种现象的原因可能有两种: () La3+造成-LTX 四聚体的解聚从而抑制毒素形成孔 道; () 即使孔道可以形成, 细胞外液中的 La3+也可 以使孔道的结构不稳定并快速地阻断通道21. 有人认为, 细胞内钙库的 Ca2+释放对于-LTX 在细胞外液中没有 Ca2+时发挥功能起到了关键的作 用14,15. -LTX 毒素刺激受体 CIRL, 这种受体同 G 蛋白的亚基 Gq/11相互作用, 激活下
21、游效应物 PLC, 导致 PIP2的水解, 产生 IP3. 细胞质中的 IP3可以使 Ca2+从 IP3敏感的钙库(线粒体内质网)内释放出来, 从而引起细胞产生一系列的反应12. 但是使用内钙 排空剂 Thapsigargin 并不能阻断-LTX 的作用24, 而 且在-LTX 的常见作用对象突触中所存在的细胞内 钙库数量很少25. 因而目前对这种观点还存在一定 的疑问. 本研究结果表明, 在零钙外液的情况下, 野 生型-LTX 并不能导致大鼠胰腺 细胞的Ca2+i 的 变化. 这也就说明在大鼠胰腺 细胞中胞内钙库并不 是-LTX 所有作用的关键因素. 在正常的细胞外液中, 由于-LTX 可以
22、在细胞 膜上形成穿孔, 并导致非选择性的离子内流26, 引发 很强的细胞效应. 这种现象很有可能掩盖了信号转 导引发的效应. 为了避免这种影响, 通常可以采用在 外液中加入三价阳离子阻断通道, 但是三价阳离子 可能使细胞的正常生理功能受到影响, 因而在实验 中受到很大限制. 突变毒素-LTXN4C可以很好的解 决这个问题. -LTXN4C为在-LTX 的 N 端的锚定重 复区中插入了 4 个氨基酸(Val-Pro-Arg-Gly)序列的突 变体, 这种氨基酸上的不同会导致毒素空间结构发 生很明显的变化, 不能形成四聚体, 因而在细胞膜上 就不能形成穿孔10,16,21. 但是-LTXN4C的受
23、体的亲 和力仍然和-LTX 一样, 这就说明-LTXN4C可以应 用于研究受体的信号通路上. 通过-LTXN4C的刺激 可以看到在正常外液和无 Ca2+外液中, 细胞的Ca2+i 都会升高. 许多研究都认为-LTXN4C通过与非外钙 依赖受体 CIRL 的结合, 通过 Gq/11激活 PLC, 导致 PIP2的水解, 产生 IP31214, 细胞质中的 IP3可以使 Ca2+从细胞钙库中释放出来, 这种Ca2+i升高和 -LTX 在正常外液中引发的现象不同, 它可以比较 快地通过细胞内的各种Ca2+i调节机制回到静息水 第 51 卷 第 1 期 2006 年 1 月 论 文 48 平. 这些
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- LTX LTXN4C 通过 不同 机制 促进 胰腺 细胞 CA2I 升高
链接地址:https://www.31doc.com/p-3694541.html