α粒子和NNK联合作用的细胞遗传毒性.pdf
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1、中华放射医学与防护杂志2 0 0 6 年6 月第2 6 卷第3 期C h i n J R a d i o l M e d P r o t , J u n e 2 0 0 6 , V o l 2 6 , N o . 3 基 础 研 究 a 粒子和 N N K联合作用的细胞遗传毒性 李平杨吵华潘秀领曹珍山米娜陈忠民刘刚魏A李慧颖朱茂祥 摘要】 目的研究 a 粒子和4 一 甲基亚硝基一 1 - ( 3 - 毗咤基卜 1 一 丁酮( N N K ) 联合作用的细胞遗传 毒性。方法永生化的人支气管上皮细胞( B E P 2 D细胞) 分为正常对照组( N C ) , a 粒子单纯照射组 ( a ) ,
2、N N K 染毒组( N N K ) , N N K 染毒( 1 0 0 P g / rn l ) 后。 粒子照射组( N N K + a ) 和。 粒子照射后N N K 染毒 ( 1 0 0 1 cg l rn l ) 组( a + N N K ) ; 用单细胞凝胶电泳法检测D N A损伤; 用多核细胞法检测细胞次黄Offi 吟鸟a 吟核糖转移酶( H P R T ) 基因突变率; 用细胞遗传学方法检测细胞微核率。结果与相同剂量 N N K或 a 粒子单独作用比较, a 粒子和 N N K联合作用诱发 B E P 2 D细胞D N A损伤、 H P R T 基因突变率、 以及细 胞微核率均显
3、著增高; 扣除 N N K效应后, 。 粒子和 N N K联合作用诱发 B E P 2 D细胞 D N A损伤、 H P R T 基因突变率、 以及细胞微核率也明显高于a 粒子单独照射组。结论a 粒子合并 N N K的细胞遗传毒 性具有协同性。 关键词】 a 粒子照射; N N K ; B E P 2 D细胞; D N A 损伤; H P R T 基因突变; 微核 S t u d y o n c e l l u l a r g e n o t o x i c i t i e s i n d u c e d b y a l p h a p a r t i c l e s i r r a d i
4、a t i o n i n c o m b i n a t i o n w i t h N N K t r e a t m e n t L I P i n g , Y A N G Z h i - h u a ,P A N X i “ 一 。 , e t a l . I n s t i t u t e o f R a d i a t i o n M e d ic i n e , A c a d e m y o f M i l i t a r y M e d ic a l S c i e n c e s , B e ij i n g 1 0 0 8 5 0 , C h i n a C o r r
5、e s p o n d i n g a u t h o r : Z H U M a o - x i a n g , E m a i l : z h u m x n i c . b m i . a c . e n A b s t r a c t O b j e c t i v e T o i n v e s ti g a te c e l l u l a r g e n o to x i c i tie s o f a p lh a p a rt ic l e s ir r a d ia t io n in c o m b i n a ti o n w i t h N N K t r e a t
6、 m e n t . Me t h o d s E x p o n e n t i a l l y g r o w i n g i m m o rt a l i z e d h u m an b r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e ll s w e r e d i v i d e d i n t o t h e n o r m a l c o n t r o l gr o u p ( N C ) , a l p h a p a rt i c l e s i r r a d i a t i o n ( a ) , N N K a d m i n i s
7、 t r a t i o n g r o u p ( N N K ) , N N K a d m i n i s t r a t i o n ( 1 0 0 p g / m l ) f o ll o w e d b y a l p h a p a rt i c l e s i r r a d i a t i o n g r o u p ( N N K + a ) , a n d a l p h a p a rt i c l e s i r r a d i a t io n f o l l o w e d 场N N K a d m i n i s t r a t i o n ( 1 0 0 p
8、g / m l ) g r o u p ( a + N N K ) . D N A d a m a g e w e r e d e t e c t e d b y s i n g l e c e l l g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S C G E ) ; m u l t in u c l e a r c e ll a s s a y w a s u s e d to d e te c t t h e f r e q u e n c y o f th e H P R T g e n e m u t a t i o n ; c e ll m i c
9、r o n u c l e u s f r e q u e n c y w e r e d e t e c t e d b y c y t o g e n e t i c m e t h o d s . R e s u l t s I n t h e gr o u p e x p o s e d t o b o t h a l p h a p a rt i c l e s i r r a d i a t i o n a n d N N K , D N A d a m a g e , H P R T g e n e m u t a t i o n f r e q u e n c y , a n
10、d c e l l m i c r o n u c l e u s f r e q u e n c y w e r e s i g n i f i c ant l y h i g h e r t h a n t h o s e i n t h e s a m e d o s e g r o u p s i r r a d i a t e d w i t h a l p h a p a rt i c l e s o r N N K a d m i n i s t r a t i o n a l o n e . S u b t r a c t e d t h e N N K e ff e c t
11、, D N A d a m a g e , H P R T g e n e m u t a t i o n f r e q u e n c y a n d c e l l m i c r o n u c l e u s f r e q u e n c y i n t h e g r o u p ir r a d i a t e d场 a l p h a p a rt i c l e s i n c o m b i n a t i o n w i t h N N K a d m i n i s t r a t i o n w e r e s i g n i fi c a n tl y h i g
12、 h e r t h a n t h o s e o f a l p h a p a rt i c l e s i r r a d i a t i o n a l o n e .C o n c l u s i o n T h e g e n o t o x i c i t y o f a l p h a p a rt i c l e s i r r a d i a t i o n i n c o m b i n a ti o n w i t h N N K a d m i n i s t r a t i o n h a d s y n e r g i s t i c e ff e c t K
13、e y w o r d s ) A l p h a p a rt ic l e s ir r a d ia t i o n ; N N K ; B E P 2 D c e l l s ; D N A d a m a g e ; H P R T g e n e m u t a t i o n ; Mi c r o n u c l e u s 研究证实人类8 0 %一 9 0 %的肺癌发生与吸烟有关 i 7 0 吸烟与癌症有密切关系是因烟草中含有多种致癌物。在目 前已明确的5 0 多种烟草致癌物中, 甲基亚硝胺毗陡基丁酮 ( N N K ) 含量多、 致癌力强, 是一种颇具代表性的烟草特异致 癌物
14、, 被广泛用于有关烟草致癌的研究 z 1 。近年来大量的流 行病学调查分析表明, 肺癌除与吸烟有关外, 氨及其子体的 暴露也是引起肺癌的一个重要的环境诱因。国际癌症研究 机构( I A R C ) 早在 1 9 8 8 年已将氨及其子体划归为I 类致癌因 素川。在正常本底地区, 人类每年由于吸人氧及其子体所产 生的辐射剂量约占全部天然辐射剂量的5 4 %0 l a a 粒子和 N N K有许多机会共同作用于人群, 研究 a 粒子和 N N K联合 作用的类型及其机制, 为平时的辐射与吸烟联合暴露下人群 的医学防护、 肺癌诊治及危险度评价提供一定的理论依据, 本实验从 D N A损伤、 基因突变
15、、 微核等方面来阐述 a 粒子和 N N K的联合生物学效应。 材料和方法 作者单位: 1 0 0 8 5 0 北京, 军事医学科学院放射与辐射医学研 究所 通讯作者: 朱茂祥, E m a i l : z h u m x n i c . b m i . a c . c n 1 . 试剂与设备 L H C - 8 完全培养液购自美国B i o fl u i d 公司; N N K ( C h e m s y n S c i e n c e l a b , 纯度大于9 8 %) 用H a n k 液配成5 m g / m l 的溶液备 用; 细胞松弛素B ( C a l b i o c h e
16、m) 用D M S O ( S i g m a ) 配成1 m g / m l 的原液; 6 一 硫鸟嗦吟( 6 - T G , s ig m a ) 用少量5 m o U L N a O H溶解, 2 3 0中华放射医学与防护杂志2 0 0 6 年6 月第2 6 卷第3 期C h i n J R a d i o l M e d P ro t , J u n e 2 0 0 6 , V o l 2 6 , N o . 3 再用0 . 9 %无菌生理盐水配成5 m g / m l 备用; 其他普通生物化 学试剂均为市售商品。 照射源用2 3 8 P u 0 : 平板电镀源, 总活 度1 . 9
17、6 x 1 0 8 M B q , 。 粒子能量为5 . 3 4 M e V , 平均剂量率1 . 1 G y / m i n o 2 . 细胞培养及分组 人乳头瘤病毒( H P V - 1 8 ) 永生化的人支气管上皮细胞( 简 称 B E P 2 D细胞) 由美国国立癌症研究所 H a r r i , 教授提供, 美 国哥伦比亚大学放射生物研究中心 D r . H e i T K处引进, 用 L H C - 8 培养液在5 % C 0 2 , 3 7 条件下培养, 细胞每周传代 1 次, 传代后第3 天换液。 将指数生长的B E P 2 D细胞, 以3 x 1 0 5 / 皿接种于自制 6
18、 0 m m a 照射皿底部的2 . 0 t a n M y l a r 膜上, 培养4 8 h 后分组: 正常对照组, 不进行任何处理; 单纯 a 粒子照射组, 用 a 照 射源对细胞进行不同剂量照射; 单纯 N N K处理组, 用不同 浓度 N N K处理细胞; 。 粒子照射合并 N N K染毒组, 按作用 顺序, 分为先N N K ( 1 0 0 tt g / m l ) 染毒后进行不同剂量。 粒子照 射, 以 及不同剂量。 粒子照射后N N K ( 1 0 0 p g / m l ) 处理。 3 . 单细胞凝胶电泳 实验细胞经 。 粒子照射和( 或) N N K处理 2h 后, 按以下
19、 程序操作: 制片: 将 0 . 5 %的琼脂糖滴在摩砂载玻片上, 立 即加盖玻片, 常温固化 1 0 m i n 。将细胞在 3 7 下按 1 : 3的比 例与0 . 5 %低熔点琼脂糖充分混匀, 加到第 1 层胶上, 立即加 盖玻片, 4 固化2 0 m i n 。小心取下盖玻片, 滴加7 5 川0 . 5 % 低熔点琼脂糖, 加盖玻片冷却硬化。裂解: 取下盖玻片, 将 凝胶载玻片浸人新配制的裂解液( 2 . 5 m o l / L N a C l , 1 0 m m o l / L t r i s , l %月桂酞肌氨酸钠, 1 0 0 m m o l / L E D T A Z N a
20、 t , p H 1 0 , 用前 加1 % T r it o n 和1 0 % D M S O ) , 4 裂解2 h a解旋: 从裂解液 中取出载玻片, 用蒸馏水洗去多余的盐分, 移人水平电泳槽 解旋2 0 一 3 0 m i n ( 1 m m o l / L E D T A Z N a t , 3 0 0 m m o l / L N a O H , p H 1 3 ) 0 电泳: 电压 2 0 V , 电流 2 0 0 m A , 低温避光, 电泳 2 5 m i n x染色和观察: 0 . 4 m o l / L T r is ( p H 7 . 5 ) 漂洗3 次, 每次5 m i
21、 n , 然后滴加5 ji g / m l 澳化乙 锭5 0 l d , 放置4 避光保存, 2 4 h 内观察。观察时选择激发波长4 0 0 n m , 光栅波长5 9 0 n m , 视 野2 0 0 倍, 拍摄单细胞影像, 每个剂量3 张片子, 每片随机观 察5 0 0 个细胞, 计算拖尾细胞数, 测定彗星细胞尾部 D N A含 量和拖尾距离。 4 . 细胞 H P R T 基因突变检测 实验细胞经 a 粒子照射和( 或) N N K处理2 4 h 后, 收集细 胞, 转至2 5 c m x 2 5 c m培养瓶中继续传代培养, 至第5 代时, 分为两组, 其中一组加人6 - T G终浓
22、度0 . 1 m m o l / L ) 3 7 培养 3 0 h , 同时向两组加人6 ,t rg / m l 的细胞松弛素 B , 继续培养4 2 h , 消化制备细胞悬液, 甲醇一 冰醋酸( 3 : 1 ) 固定, 细胞悬液滴 片, G i e m s a 染色, 干燥后光镜下计数 5 0 0 1 个细胞, 记录在同一 胞浆内具有完整核膜的双核或多核细胞( 包括相压、 相切和 分离的双核或多核细胞数) 。含有 6 - T G培养细胞中的 1 0 0 0 个细胞中双核或多核细胞数除以不含6 - T G培养的1 0 0 0 个细 胞中双核或多核细胞数, 所得结果为 H P R T 基因位点突
23、变频 率( %) 。 5 . 细胞微核率检测 实验细胞经a 粒子照射和( 或) N N K处理2 4 h 后, 用预温 的D - H a n k 液洗涤2 一 3 次, 消化制备细胞悬液, 离心弃上清, 加人0 . 0 7 5 m o l / L K C 1 溶液5 . 0 m 1 , 3 7 低渗处理 1 5 一 2 0 m i n , 加人甲醇: 冰醋酸固定液( 3 : 1 ) 1 m l , 混匀预固定, 离心弃上 清, 加固定液0 . 5 m l 固定 2 0 m i n , 细胞悬液滴片, G i e m s a 染色 干燥后油镜观察细胞, 计数每 1 0 0 0个细胞中有微核的细
24、胞数 。 日息侧事暖勒 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 00 2 0 0 4 0 0 403020100 岁叫如V舀最吹盈寻酬勒 nUljo 064 岁瓣州绷理界吹裸 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 N N K浓度( w g l m l )N N K浓度( 4 g / m l )N N K浓度( g g / m l ) nC曰nIJnCO 气月崎八、,一心.几且 图1 N N K 诱发B E P 2 D 细胞D N A 损伤的剂量效应曲线 6 0 r 日息侧率喊架侧篇叫拯 n们nU八曰nonU j月,IJZI 岁训如奎0最叹理界叫物 别6C4020 岁哥州绷
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- 粒子 NNK 联合 作用 细胞 遗传 毒性
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