【SN商检标准大全】SNT 2121-2008 流行性造血器官坏死病检疫技术规范.pdf
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1、书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖犜 流行性造血器官坏死病 检疫技术规范 犘 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 狅 犳狇 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲 犳 狅 狉犲 狆 犻 狕 狅 狅 狋 犻 犮犺 犪 犲 犿 犪 狋 狅 狆 狅 犻 犲 狋 犻 犮狀 犲 犮 狉 狅 狊 犻 狊 发布 实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 书书书 前 言 本标准
2、修改采用了国际兽疫局( ) 水生动物疾病诊断手册 ( 版) 的第 章。 本标准与 水生动物疾病诊断手册 ( 版) 的第 章相比, 主要差异如下: 对样品处理以及试验条件进行了调整和优化, 如核酸抽提采用 酚 三氯甲烷方法; 重新编排了格式。 本标准的附录为规范性附录, 附录、 附录、 附录、 附录均为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、 中华人民共和国广州出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人: 刘荭、 乌日琴、 江育林、 叶奕优、 何俊强、 史秀杰、 高隆英。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 犛 犖犜
3、 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 流行性造血器官坏死病 检疫技术规范 范围 本标准规定了流行性造血器官坏死病病原分离、 酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应检测方法。 本标准适用于流行性造血器官坏死病的检疫。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件, 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否
4、可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件, 其最新版本适用于本标准。 分析实验室用水规格和试验方法( , : , ) 出入境动物检疫采样 概述 流行性造血器官坏死病( , ) 是由流行性造血器官坏死病毒 ( , ) 引起的有鳍鱼类一种疾病( 参见附录 ) 。 试剂和材料 水: 符合 中一级水的规格。 参考株: 由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。 细胞系: ( 铜吻鳞鳃太阳鱼成纤维细胞系) 、 ( 一种鲤科鱼类的细胞系) , ( 鲤鱼上皮瘤 细胞系) , ( 大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系) 。用 培养液( 见附录第 章) 培养。 羟乙基哌嗪乙磺酸( ) 。 抗体: 由国家质量监督检验检疫
5、总局指定单位提供。 犜 犪 狇 酶: 保存, 不要反复冻融或温度剧烈变化。 : 含 、 、 、 各 。 引物: 浓度为 。其序列如下: : : 扩增主要衣壳蛋白基因中 的片段。 : : 扩增主要衣壳蛋白基因中 的片段。 异丙醇: 分析纯, 使用前预冷到 。 矿物油: 要求无 酶和 酶, 用于无热盖的 扩增仪。 :( 体积分数) 。 器材和设备 孔细胞培养板、 不同规格的细胞培养瓶。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册
6、 即可下载 倒置显微镜。 恒温培养箱。 普通冰箱和超低温冰箱。 组织研磨器。 离心机和离心管。 扩增仪。 水平电泳仪。 不同规格的微量移液器及吸头。 紫外观察灯或凝胶成像仪。 制冰机。 高压灭菌器。 犈 犎 犖 犞的分离 采样 有临床症状的鱼, 体长小于 的鱼苗取整条鱼后, 去头和尾: 体长 的鱼苗取内脏( 包 括肾) ; 体长大于 的鱼则取肝、 肾和脾。取样数量按照 的规定。 样品处理 先用组织研磨器将样品匀浆成糊状。再按 的最终稀释度重悬于培养液中。如果在匀浆前未 用抗菌素处理过样品, 则须将样品匀浆后再悬浮于含有 青霉素和 链霉素的 培养液中, 于 下孵育或下孵育 。 离心 , 收集上清
7、液。 病毒分离 细胞传代使用胰酶 消化液( 见附录 第 章) 。对 的组织匀浆上清液再作两次 倍稀释, 然后将 、 、 个稀释度的上清液分别接种到生长 以内的 孔板里 的细胞单层中, 每孔的细胞单层最多接种 稀释液。 吸附 后, 加入细胞 培养液( 见附录第 章) 。置于 培养。试验设个阳性对照( 接种 标准株) 和个空白 对照( 未接种病毒的细胞) 。 阳性对照和待测样品都接种细胞后, 内每天用倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如 果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变( ) , 应立即进行鉴定。 表现为局部 区域细胞开始裂解, 周围细胞收缩变圆, 逐渐发展, 细胞最终全部脱
8、落。如果除阳性对照细胞外, 没有 出现, 则在培养后还要用敏感细胞进行盲传。传代时, 将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单 层培养物冻融一次, 以 、离心 , 收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层, 培 养 , 每天镜检。 如果阳性对照也未出现 , 则必须换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒 学检查。 犈 犎 犖 犞的犘 犆 犚检测 样品处理 将 细胞病变悬液或组织悬液, 放入 的离心管, 再加入 溶液( 见附录 第 章) 并混匀, 作用 。 病毒 犇 犖 犃抽提 在含有样品的塑料离心管中加入 抽提液( 见附录 第 章) , 用力混合至少 。 离心 , 小心取上层水相( 约 )
9、 。加入 抽提液( 见附录第 章) , 用 力混合至少 。 离心 , 小心取上层水相( 约 ) 。加入 预冷的 倍 体积的无水乙醇( 约 ) , 倒置数次混匀后, 以上沉淀核酸。 离心 , 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 小心倒去上清液, 倒置于吸水纸上, 吸干液体。 干燥 ; 最后加 水溶解后, 作为 模板。 目的 犇 犖 犃片段扩增 反应体系为 : 在 反应管中加入 , 和 或者 和 各 , 的氯化
10、镁( ) ( 见附录第 章) 、 倍 犜 犪 狇 酶 倍浓缩缓冲液( 见 附录第 章) 、 犜 犪 狇 酶、 模板 , 加水到总体积 。如使用无热盖的 扩增 仪, 需在反应混合物上覆加 矿物油。混匀后低速离心, 让矿物油在上层。再将反应管置于 扩增仪。 变性 ; 变性 、 退火 、 延伸 , 次循环; 延伸 。 设立对照 在 中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、 阴性样品对照、 空白对照。 取含有已知的病毒标准株的细胞悬液作为阳性对照。 取正常的鱼组织抽提核酸作为阴性对照。 取等体积的水代替模板作为空白对照。 琼脂糖电泳 用 ( 见附录第 章) 电泳缓冲液配制 的琼脂糖( 含 , 见附录第
11、 章) 平板。将平板放入水平电泳槽, 使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将 扩增产物和上样缓冲液 ( 见附录第 章) 按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。 电泳约 , 当溴酚蓝到达底部时停止。 结果判定 在紫外观察灯上或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。 后阳性对照会分别出现 和 的 片段, 阴性对照和空白对照没有该扩增带。 待测样品电泳后, 引物 和 的扩增产物( 参见附录 ) 在 的位置上有带, 引物 和 的扩增产物( 参见附录 ) 在 位置上都有带者, 取 扩增产物测序或进 行酶切反应, 同参考序列或酶切反应结果( 参见附录) 进行比较, 符合的可判断待测样品结果为阳
12、性。 无扩增带或扩增带的大小不是 和 的为阴性。 犈 犎 犖 犞的抗原捕获犈 犔 犐 犛 犃检测 样品处理 同病毒分离。 微量板包被和封闭 将一抗( 兔抗或者鼠抗抗体) 用 的包被缓冲液( 见附录 第 章) 作适当稀释后 包被 微量反应板, 每孔 。孵育过夜。 用 ( 见附录第 章) 洗次。用封闭液( 见附录 第 章) 于 下封闭 。 用 洗次。 病原检测 在孔内分别加入 含有待测病毒的细胞培养液或组织悬液, 另将阳性对照、 正常组织样品( 阴 性对照) 和细胞培养液( 空白对照) 也各加孔。 下反应 。用 洗次。 各孔加一定稀释度的第二抗体( 抗 的抗血清) , 下反应 。用 洗次。 每孔加
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