一种快速可靠的豚鼠心室肌细胞分离法.pdf
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1、第2 6 卷第2 期 2 0 0 3年 6月 武汉科技大 学学报 (自然科 学版 ) J . o f Wu h a n U n i . o f S c i . 电生 理学; 心肌; 豚践 中圈分类号: R - 3 3 2文似标识码: A文章编号: 1 6 7 2 一 3 0 9 0 ( 2 0 0 3 ) 0 2 一 0 2 0 ( - 0 2 以膜片钳技术进行电生理学研究需要单个细 胞标本的合理制备, 其好坏是实验成败的关键所 在。醉解分离法一直是由电生理学尤其是膜片钳 实验所采用的方法, 要求分离出来的细胞结构完 整, 有呼吸活性, 耐C a Z 性强, 胞膜平整清沽, 而 后者恰好是形成
2、膜片钳高阻封接所必需的。此 外, 采用心室肌细胞进行膜片钳制研究, 必会在分 离过程中 耗费大量价格昂贵的酶及动物。因此有 必要摸索出 快速、 经济有效的分离方法, 以 适宜于 我国国情需要, 并为研究细胞膜离子通道活动提 供先决条件。 1 材料与方法 豚鼠2 8 0 一 3 0 0 g 一只, 雌雄不拘, 在其腹腔注 2 0 0 0 肝素, 2 0 m i n 后以3 %的戊巴比 妥钠1 m Uk g 麻醉后, 迅速开胸取心, 置于4 的用氧氧合的无 C a t 液中, 清除心脏 周围 结 缔组织及心包膜, 经主 A 逆行 插 管 后连于L a n g e n d ro f t 装置 。 然
3、 后依 次按下述液体步篆灌洗心脏: ( I ) 无C a , 台氏液冲 洗3 一 5 m i n i 1 , 在此过 程中观察到心脏流出液逐渐变清, 心跳停止。灌 洗速度不宜太快, 以 浦洗流出液为点滴连续为宜。 灌洗同时吸 取 恒温、 氧 合的 无C a l 十 液冲 洗心脏表 面, 以 便清洗表面血块及维持心脏表面温度( 个 别情况无C a 液灌洗时心跳持续, 但仍要求以 5 m i n 为限) 。 ( 2 ) 消化液灌洗2 一 3 m i n , 可见 1 m i n 左右, 灌洗流出液逐渐粘稠、 拉丝, 心脏膨大, 颜色变浅, 呈粉红色。消化时所需关注的要点: 由于心脏个 体之间大小差
4、异, 可能消化时间略有不同, 但最长 不能超过3 m i n 。此时心脏外观不能出现苍白 及 泛黄, 否则分离出的细胞均不能耐 C a “ o ( 3 ) 消化后一般要求以 无C a Z 十 液冲洗( 或低 C 扩 十 液2 5 0 1 t m o l/ L ) 终止消化。此步骤限时 3 m in 。 然后取下心脏在无C a 2 , 液中 剪下心室并 打开心腔( 所用液体与终末灌洗液一致) , 以心室 组织块贴片观察( 或吸取上清液观察有无细胞游 离, 或剪碎心室肌, 用吸耳球顺时针吹打( 要求在 恒温下进行) 。 3 m i 。 后过滤即可得到实验要求的 细胞。 通常按上述办法, 过滤所得细
5、胞会逐渐增 多, 且均为横纹清晰, 折光性强的 单个细胞。 ( 4 ) 过建所得细胞悬液均以5 倍于其体积的 K B 液 保 存 3 1 ( 或以 含5 0 0 p m o V L 的 低C a z 保 存 液稀释静置 1 5 m i n后, 去上清液, 继续以含 1 m m o l / L C a 保存液, 保存细胞待用) , 所用液体 均须以 1 0 0 %氧合恒温 3 6一3 6 . 5 9C 。压力为 7 5 c m H , O , 2 液体配制 液体配制如下: ( 1 )无 C a t 台氏液( m m o l/ L ) : N a C l 1 3 5 ; K C 1 5 . 4 ;
6、 N a H , P 0 4 1 . 2 ; G l u c o s e 1 0 , 以N a O H调 p H至7 . 3 一 7 . 4 0 ( 2 ) 消化液: 胶原酶I ( G I B C O ) 2 m g ; 蛋白酶 E 0 . 5 M G ; 牛血清蛋白( s . g m a ) 5 m g ; 溶解于3 0 m L 无钙台氏液中。 ( 3 ) 终止消化液: 无 C a 台氏液 + B S A ( 1 5 m g / 5 0 m L ) 或2 5 0 m m o l/ L低C a 2 台氏液+ B S A ( 5 m g / m L ) a ( 4 ) 保存液: K B ( l
7、0 0 m L )+ B S A ( 3 0 m g ) 或 1 m m o l / L 含C a 台氏 液+ B S A ( l m 岁 m L ) a ( 5 ) K B ( n u n o l / L ) ; K O H7 0 ; K C 1 4 0 ; K H , P O , 2 0 ; 谷氨酸5 0 ; M g C l, l ; 牛磺酸 2 0 ; E G T A 1 0 ; G l u c o s e 1 0 ; K O H调p H至. 7 . 3 一 7 . 4 0 收稿日 翔: 2DD 2 一 璐一 仲 作密简介: 张培华( 1 9 6 2 -) . 女, 武权科技大学医学院,
8、 实脸师, 万方数据万方数据 2 0 0 3 年第2 期张培华, 等: 一种快速可靠的豚鼠心室肌细胞分离法 2 01 值得注意的是, 我们以改良的保存液终止消 化及孵育 K B ( 1 0 0 m L ) + B S A ( 1 5 m g ) 所得细胞 一样符合实验要求。 3 结果 用上述方法分离出来的 豚鼠 心室肌细胞在光 镜下, 横纹清晰, 且杆状耐c a t . 细胞比 率在7 0 % a 二 8 0 %。 表明 本方法细胞分离质量高, 失败率低, 观 察简 便, 快捷, 溶液配比 简单经济, 耗酶少。 实 验时台氏液灌流细胞, 杆状细胞大多处于静止状 态, 表明其具有耐C a + 性
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- 一种 快速 可靠 豚鼠 心室 细胞 分离法
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