三嵌段高分子骨组织工程支架材料的制备及细胞粘附性研究.pdf
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1、24 卷 2 期 2005 年 4 月 中国生物医学工程学报 Chinese Journal of Biomedical Engineering Vol.24No.2 April2005 收稿日期:2003-12-26,修回日期: 2004-09-15。 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30200063; 30170270) 。 三嵌段高分子骨组织工程支架材料的制备及细胞粘附性研究 郝杰1郑启新1郭晓东1杨大志1宋玉林1全大萍2罗丙红2 1 (华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科, 武汉430022) 2 (中山大学高分子材料研究所, 广州510275) 摘要:目的制备三嵌段高分子骨
2、组织工程支架材料 聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇, 并比较与聚丙 交酯-共-乙交酯材料对骨髓基质细胞的粘附性, 为骨组织工程支架材料的选择提供依据。方法通过本体开环共 聚法合成聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇三嵌段共聚物, 用红外光谱检测; 利用高温显微镜测定两种材料的 表面接触角; 体外培养骨髓基质细胞, 然后分别接种至上述两种材料上, 测定细胞粘附率和细胞粘附力, 并进行扫 描电镜观察。结果红外光谱证明聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇三嵌段共聚物形成; 聚丙交酯/乙交酯/ 天冬氨酸-聚乙二醇材料的表面接触角是 63.3 度, 聚丙交酯-共-乙交酯材料的表面接触角是 67.5
3、度; 细胞粘附率分 别为 69.7%和 61.3%; 细胞粘附力分别为 321.15 92.39 10- 10牛顿和 216.96 73.76 10- 10牛顿; 扫描电镜观察结 果为聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料表面粘附的细胞数明显多于聚丙交酯-共-乙交酯材料表面粘附的 细胞数。结论聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料的粘附性优于聚丙交酯-共-乙交酯材料的粘附性, 是一 种理想的骨组织工程支架材料。 关键词:组织工程;生物材料;聚乳酸;细胞粘附;骨髓基质细胞 Preparation and Cell Adhesion of Tri-Block Polymer Scaffolds
4、 in Bone Tissue Engineering HAO Jie1ZHENG Qi-Xin1GUO Xiao-Dong1YANG Da-Zhi1SONG Yu-Lin1QUAN Da-Ping2LUO Bing-Hong2 1 (Department of Orthopedics, Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong Science and Technology University, Wuhan 430022) 2 (Institute of Polymer Science, Zhongshan University,
5、Guangzhou 510275) Abstract:ObjectivesTo prepare poly (lactic acid/glycolic acid/asparagic acid-co-polyethylene glycol)(PLGA- ASP-PEG ) ,compare the adhesion behaviors of marrow stromal cells (MSCs) to PLGA- ASP-PEGtri-block copoly- mers and poly (lactic acid-co-glycolic acid)(PLGA) . MethodsThe PLGA
6、- ASP-PEGtri-block copolymers were obtained through bulk ring-opening copolymerization method and examined by the infrared spectrometer (IR) .The sur- face contact angles were measured with high temperature microscope.The marrow stromal cells were cultured in vitro, and then were seeded onto above t
7、wo materials.The cell adhesive rates were measured by sedimentation.The cell ad- hesive forces were measured by micropipette aspiration technique.The adhesive conditions of MSCs on the materials were observed by scanning electron microscope.ResultsThe PLGA- ASP-PEGwas synthesized as designed, which
8、was proved by IR spectrometry. The surface contact angle of PLGA- ASP-PEGwas 63.3, while the PLGA s was 67.5.The cell adhesive rate was 69.7% and 61.3% respectively for PLGA- ASP-PEGand PLGA.The cell adhe- sive forces were 321.15 92.39 10- 10N and 216.96 73.76 10- 10N respectively.The density of MSC
9、s of PL- GA- ASP-PEGsurface was much higher than that of PLGA.ConclusionsPLGA- ASP-PEGexhibitied better cell adhesiveness than that of PLGA.It is an ideal scaffold for bone tissue engineering. Key words:tissue engineering;biomaterials;polylactic acid (PLA) ;cell adhesion;marrow stromal cells (MSCs)
10、中图分类号R318.08文献标识码A文章编号 0258-8021 (2005) 02-0129-05 引言 聚乳酸 (polylactic acid, PLA) 、 聚乙醇酸 (polygly- colic acid, PGA) 以及两者的共聚物 (poly (lactic-co-gly- colic) acid,PLGA) 属于聚酯类可降解基质材料, 具有 良好的生物相容性和一定的力学强度, 是目前骨组 织工程研究中最常用的细胞支架材料。但是这类材 料存在对细胞的粘附性较差以及分子链中缺乏活性 功能基团等问题。为此, 我们和中山大学高分子研 究所共同研制出一种新型支架材料 聚丙交酯/ 乙交酯
11、/天冬氨酸 (asparagic acid, Asp) -聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG)(PLGA- ASP-PEG ) 三嵌段 共聚物。本研究比较了 PLGA- ASP-PEG 材料和 PLGA 材料的细胞粘附性, 为今后组织工程支架材 料的筛选和优化提供依据。 1材料与方法 1.1主要仪器和试剂 Nicolet 205 型傅立叶变换红外光谱仪; 2AP 高温 显微镜 (西德莱茨公司) ; 倒置相差显微镜 (Axiovert 35, Zeiss Corp, Germany) ; 显微操作器 (MR5170, Ep- pendorf Corp, Germany)
12、 ; 摄像记录系统和时标发生器 (VTG For A Corp, Japan) ; 负压控制、 加载装置和图像 处理器 (Vidas 21, Kontron Corp, Germany) ; 吸管拉制 器 (P87 model, Sutter Instrument Corp, USA) ; 扫描电镜 (日立 X-650 型) ; N- (苄氧羰基) -L-天冬氨酸 (N-CBz- L-ASP)(ACROS ORGANICS 公司) : PEG200 (广州市 医药公司化学试剂玻璃仪器批发部) ; DL-LA, 通过 乳酸合成; GA (Sigma) ; 氯化亚砜 (SOCl2)(广州化学 试剂
13、厂) ; 对甲苯磺酸 (常州市新华活性材料研究 所) ; Sn (Oct) 2 ; P bCL (上海东岭金属材料有限公司) ; 活性炭 (广州化学试剂厂) 。低糖 DMEM 培养基 (Gibco) ; 小牛血清 (武汉亚法) ; 胰蛋白酶 (Sigma) ; 地 塞米松 (Sigma) ; 维生素 C (Sigma) ; -甘油磷酸钠 (Sigma) ; 24 孔培养扳 (Corning) 。 1.2生物材料的制备及处理 根据参考文献 1, 2 , 由原料 N-CBz-L-ASP 在 SOCl2催化作用下生成 N-CBz-L-天冬氨酸酐, N-CBz- L-天冬氨酸酐在对甲苯磺酸的催化作用下
14、进一步与 PEG200 溶液缩聚得到 ASF-PEG 交替预聚物; 再以 Sn (Oct) 2 为催化剂, ASF-PEG 为大分子引发剂共同 引发 DL-LA、 GA 开环共聚; 共聚物侧氨基上的 CBz- 保护基团在 5wt%的 Pb/CL 催化作用下直接通 H2脱 除, 由此得到共聚物。粗产物经氯仿溶解, 乙醇沉降 纯化; 产物经减压干燥, 制成膜材, 约 1cm 1cm 0.1cm大小。PLGA- ASP-PEG-10% 的平均分子量 为 22.15 103。超声波清洗, 自然干燥, 环氧乙烷消 毒备用。PLGA 材料也由中山大学高分子研究所制 备, 制成同样大小, 环氧乙烷消毒备用。
15、 1.3MSCs 培养 取 4 周龄健康 SD 大白鼠, 体重约 120g, 雌雄不 限, 10%水合氯醛腹腔注射麻醉, 双侧下肢剪毛, 75%酒精浸泡消毒 30min (将大白鼠头露于外面) , 无 菌条件下取出双侧胫骨和股骨, 剪除骨端, 10 号注 射器抽取 1ml DMEM 完全培养基 (含 20%小牛血清, 100u/m1 青霉素, 100g/ml 链霉素) 自一端冲洗, 制 成单细胞悬液, 以 3 106/ml 细胞数接种至 100ml 培 养瓶中, 置于 37、 5% CO2及饱和湿度孵育箱中, 24h 后全量换液, 以后每 3d 换液一次。待细胞汇合 成单层后, 用 0.25%
16、胰蛋白酶进行 1:4 消化传代, 接 种密度为 2 105/ml, 继续用条件培养基 (含 10%小 牛血清、 10mmol/L-甘油磷酸钠、 50mg/L L-抗坏血 酸、 1 10- 8mol/L 地塞米松) 培养。取第 3 代的细胞 进行测定。 1.4红外光谱 (IR) 分析 KBr 涂膜制样, CHCl3为溶剂, 用傅立叶变换红 外光谱仪检测。 1.5表面接触角测定 取平整的 PLGA- ASP-PEG-10% 材料和 PLGA 材料膜片各 6 块, 去离子水冲洗, 常温干燥, 用高温 显微镜 (放大 14 倍) 于常温下进行膜表面的接触角 测定, 结果取平均值。 1.6细胞粘附率检测
17、 沉淀法取 24 孔培养板, 在孔内植入备用的 PLGA- ASP-PEG-10% 材料 5 块, 大小约 1cm 1cm。 将细胞浓度为 2 105/ml 的细胞悬液 0.5ml 滴加到 材料上。置于孵育箱中复合培养 4h 后, PBS 冲洗, 去除未粘附的细胞。用 0.25%胰蛋白酶进行消化, 收集细胞并记数, 计算细胞粘附率。细胞粘附率计 算公式为: 粘附率 = 粘附细胞数/总细胞数 100%。 对照组用 PLGA 材料, 处理方法同上。 1.7细胞粘附力的测定 微吸管吸吮法用吸管拉制器拉制微吸管, 外 径 2mm, 内径 1mm, 长 100mm。用丙酮作为溶剂, 按 31.25mg/
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