丁内酯Ⅰ对小鼠卵母细胞体外成熟及发育能力的影响.pdf
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1、第2 5 卷第7 期V o l . 2 5 , N o . 7 2 0 0 5 年7 月J u l , 2 0 0 5 生殖与避孕 R e p r o d u c t i o n 培养 6 h 时 , 1 0 0 p m o 比才 能 抑制未 成熟卵 的G V B D . 两 种情况 下 ,各组间 的 成熟 率无差 异。 6 .2 5 p m o l 几 组卵母细胞的受精率( 8 3 . 1 ) 和囊胚形成率 2 5 .4 %) 虽低于体内 成熟组 9 3 .3 %和4 6 .4 %) , 但 显著地高于体外成熟组 ( 5 9 .9 %和4 . 9 %) 。结论: B L - I 能可逆性地抑
2、制小鼠未成熟卵的核成熟且 不影响其成熟能力, 适量的B L - I 对核成熟的短暂性抑制可显著提高小鼠未成熟卵的发育能力。 关键词: 丁内醋- I ( B L - I ) ;卵母细胞;体外培养;小鼠 中图分类号:8 3 3 9 .2文献标识码: A文章编号: 0 2 5 3 - 3 5 7 X ( 2 0 0 5 ) 0 7 - 0 3 9 6 - 0 4 未成熟卵经体外培养成熟后普遍存在发育能力 下降的问 题。一般认为, 其发育能力下降是由于细 胞核和细胞质成熟的不同步所致,也就是说,当 未成熟卵离开窦卵泡的抑制环境后,核的成熟加 快, 以致当核成熟时, 胞质尚未完全成熟川 。因此, 暂 时
3、抑制卵母细胞核成熟的物质引起了人们的关注。 T内 醋- I ( b u t y r o l a c t o n e - 1 , B L - I ) 能 抑制 成熟 促 进因 子 ( m a t u r a t i o n p r o m o t i n g f a c t o r M P F )的 活性,因而能阻滞减数分裂的恢复2 ,3 。同时B L - I 是一种选择性的M P F 抑制剂 ,比较其它的抑制剂 如3 一 异丁基一 甲 基黄嚓吟( I B M X ) , 6 一 二甲 基氨基 嗓吟 ( 6 - D MA P )等,其对细胞内的其它生理活 动影响较小5 。因而B L - I 可被
4、用来短暂性抑制未成 熟卵核的成熟,使其与胞质的成熟达到同步化。 目 前,B L - I 仅被用于牛、猪等家畜未成熟卵的体 外培养研究2 ,3 ,6 ,对小鼠则未见报道。本研究以昆 明小白鼠为模型,用B L - I 暂时抑制卵母细胞的核 成熟,了解这一过程对卵母细胞体外成熟及发育 能力的影响,为如何改善体外培养的卵母细胞发 育能力提供依据。 1 材料与方法 通讯作者: 张 玲; T e l :+ 8 6 - 2 7 - 6 2 6 7 9 0 5 3 ; E - m a i l : z h l in g 3 2 1 6 3 . c o m 1 . 1 材料 1 . 1 . 1试剂 B L - I
5、 购自 美国B i o m o l 公司,a 一 最 低必需培养基 ( a - M E M) 购自 美国H y c l o n e 公司, 孕马血清促性激素 ( P MS G)购自天津华孚高新 生物技术公司, h MG , h C G为珠海丽珠制药的产 品, H e p e s 、青霉素G、 链霉素、 丙酮酸钠、二 甲亚飒 ( D MS O) 均购自 美国A m r e s c o 公司,I V F - 2 0 购自 瑞典V i t r o l i f e 公司。 1 . 1 . 2 实 验动物卵母细胞采自 5 - 6 周龄雌性昆明 小白鼠,体重1 8 - 2 5 g , 精子取自1 2 周龄
6、以 上的 - 3 9 6 - 雄性昆明小白鼠, 体重3 5 g 左右,以 上小鼠 均为 清洁级,来自华中科技大学同济医学院动物房。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 培养液的配制将a - ME M用超纯水溶解, 配制成浓缩液然后分别稀释成采卵液和体外成熟培 养液 ( 简称成熟培养液) 。采卵液含1 8 m m o l / L 的H e p e s ,成熟 培养液含丙酮酸钠0 . 2 3 m m o l / L , h M G 0 . 1 5 I U / m l , 使用前添加2 0 %的人成熟卵泡液。 两种培养液均含有链霉素0 .0 5 m g / m l , 青霉素G 0 .0 7 5
7、m g / m l 。 人 成熟卵 泡液的 制备见参 考文献 7 0 1 . 2 . 2 未成熟卵的采集及培养在小鼠 动情前期 注射P MS G 7 . 5 I U , 4 7 - 4 8 h 后处死,取其卵巢, 置于采卵液中,用5 “ 注射针穿刺其窦卵泡,使卵 丘一 卵 母 细 胞复 合 体 ( c u m u l u s c e l l - e n c l o s e d o o c y t e , C E O) 释放出来,选择外围至少包绕2 层卵丘细 胞的C E O ,在成熟培养液中清洗数遍后用微滴培 养法培养。 将B L - 1 溶解于D MS O,以5 0 m m o l / L的浓
8、度 分装,- 7 0 保存。使用前用成熟培养液将B L - 1 的 浓 度 稀 释 成6 .2 5 1 u n o l/ L , 1 2 .5 i m o l/ L . 2 5 p m o l/ L . 5 0 t m o l / L , 1 0 0 t m o l / L( 简称B L - I 培养液) 。实 验组将未成熟卵用各种浓度的B L - I 培养液分别培养 3 h 或6 h 后,用巴氏吸管吹打使C E O脱去颗粒细 胞,观察其卵母细胞发生泡破裂 ( G V B D)的发 生率,然后移入成熟培养液继续培养,在总培养 时间为1 6 h 时观察其成熟率。同时用不含B L - 1 的 成熟
9、培养液直接培养未成熟卵,作为对照组。成 熟率是指排出第一极体的卵母细胞的百分率。 比 较 实验组与对照组G V B D的发生率及成熟率, 从而确 定将卵母细胞减数分裂抑制3 h 或6 h 的最低浓度。 除注明外,每组实验至少重复3次。 1 . 2 . 3成熟卵 母细胞的采集给动情前期小鼠 注 射P MS G 7 . 5 I U , 4 8 - 5 0 h 后注射h C G 1 0 I U , 1 6 h 后处死,取其输卵管, 在采卵液中用注射针头撕开 膨大处, 即可见颗粒细胞团涌出, 将其移入I V F - 2 0 中,1 h后行体外受精 ( I VF ) o 1 . 2 . 4受精及胚胎培养
10、参考王敏康的方法8J采集 雄鼠附翠尾精子,于IVF - 2 0 中获能1 - 1 .5 h 后, 加 入到己放置成熟卵母细胞的液滴中,使其浓度在 1 0 5 - 1 0 6 / m l 之间。 I V F 后4 - 6 h 将卵母细胞捞出,置 入I V F - 2 0 中培养,隔日换液。I V F 后2 4 h 观察2 - 细胞形成情况,以2 一 细胞的形成率代表其受精率。 I V F 后9 6 h 观察囊胚形成。 将以上确定浓度的B L - 1 培养液培养未成熟卵 3 h 或6 h 后,移入成熟培养液中培养。在体外培 养总时间达到 1 8 h时,将成熟的卵母细胞进行 I V F ,观察其受精
11、及胚胎发育状况,并与3 个对照 组 ( B L - 1 0 i m o l / L 对照组、 溶剂对照组和体内 成 熟组)比较受精率及囊胚形成率。溶剂对照组指 未成熟卵在含D MS O的成熟培养液中培养6 h 后, 移入成熟培养液继续培养成熟。D MS O的浓度为 1 0 0 g m o l / L B L - 1 培养液中D M S O的浓度,为所有 实验中应用D MS O的最高浓度。 1 . 3 统计分析方法 应用护检验,比较各组间G V B D发生率、成 熟率、受精率、囊胚形成率。 2结果 2 . 1 B I A对小鼠未成熟卵成熟的影响 用B L - I 培养液培养3 h 时, 各浓度组
12、卵母细胞 G V B D发生率均低于B L - I 浓度为0 的对照组, 差异 有显著意义 ( P 0 . 0 5 ) . B L - 1 6 . 2 5 m m o l / L为抑制卵母 细胞核成熟3 h 的最低浓度。各组间的成熟率无差 异, 表明B L - I 抑制核成熟3 h 的过程不影响卵母细 胞的成熟。 由表1 可知, B L - 1 培养液培养未成熟卵6 h , 当B L - 1 浓度为1 0 0 g m o l / L 的 浓度才能 抑制其 G V B D ,由 于B L - 1 5 0 g =l/ L , 2 5 p u n o l/ L 作 用6 h 均 未能 抑 制G V
13、B D , 故 未用6 .2 5 p =I/ L , 1 2 .5 E u m l/L 两 种浓度继续6 h 抑制实验。不管B L - I 抑制3 h 还是 6 h , B L - 1 各浓度组间成熟率均无差异,且与对照 组间亦无差异,说明B L - 1 不影响卵母细胞的成熟。 2 . 2 B L - 1 对小鼠未成熟卵发育能力的影响 溶剂对照组受精率和囊胚形成率与B L 一 I O mmo l / L对照组相似,因此培养液中少量的 D MS O 不影响未成熟卵的受精及胚胎发育到囊胚的 能力。6 .2 5 m m o l / L B L - I 处理组的受精率和囊胚形 成率虽比体内成熟组低,
14、但明显高于B L - I 0 浓度对 照组。而 1 0 0 m m o l / L组的受精率虽高于B L - 1 0 浓 渡对照组,但囊胚形成率无差异。 3 讨论 抑制成熟促进因子( M P F ) 在启动卵母细胞减数 分裂的过程中起重要作用, 它由细胞周期蛋白B 和 - 3 9 7 - 表 1 不同浓度的B L - I 培养液培养未成熟卵3 h , 6 h 的G V B D及继续培养的成熟情况 T a b l e 1 G V B D o f m u r i n e i m m a t u r e o o c y t e s c u l t u r e d f o r 3 h o r 6 h
15、i n t h e m e d i a w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f B L - 1 a n d m a t u r a t i o n f o l l o w i n g r e l e a s e f r o m m e i o t i c a r r e s t B L - I M 度 ( L tmm o l/L )一 ” yJ “ - - - 一一 - , - , _一丫 一 “ 一 B L - I c o n c e n tr a tio n 3h 6h 3h 6h 3h 6h 0.1 4 6 1 4
16、6 8 5 ( 5 8 . 2 ) 1 2 0 ( 8 2 . 3 ) 1 2 2 侈 3 .6 ) 1 2 2 ( 8 3 . 6 ) 、.口产、.少 ofJ 9 ( 8 .4 ) 1 2 ( 1 2 . 8 ) 1 3 ( 1 1 . 5 ) 4 ( 4 . 7 ) 4 0 ( 8 0 . 0 ) 7 1 ( 7 3 .2 ) 2 8 ( 2 1 . 5 ) 4 0 ( 8 0 . 7 3 ( 7 5 . 1 1 0 ( 8 4 . 6 ) 50a9730 )6)7435 l(?1只 ,.足 21、J 612255000 a : 此组实 验仅重 复2 次d a t a w e r e o
17、b t a i n e d fr o m 2 r e p li c a t e s * : P 0 .0 1 与 对照组( 即B L - I 的浓度为。 组) 比 较c o m p a r e d w it h c o n t r o l ( c o n c e n t r a t io n o f B L - 1 w a s z e r o ) 表 2 B L - I 培养液对小鼠卵母细胞受精及发育能力的影响 ( 护检验) T a b l e 2 T h e e f f e c t o f B L - I o n m u r i n e o o c y t e s f e r t i l i
18、 z a t i o n a n d d e v e l o p me n t a l c o m p e t e n c e 组别 G r o u p B L 一 作用时间 伍 )成熟卵母细胞数 T i m e o f B L - 1 e x p o s u r e N o . o f m a t u r e o o c y t e s 2 一 细胞数( 0/0) No . o f t wo - c e l l ( X 2 t e x t ) 囊胚数( % ) No . o f b l a s t o c y s t 14012013771102 溶 剂 对 照 组D M S O e x p
19、 o s u r e 体内成熟组m a t u r a t i o n i n v i v o 0 p m o l/ L 6 .2 5 p m o l / L 1 0 0 p m o l / L 0 0 0 3 6 8 3 ( 5 9 . 3 户 1 1 2 ( 9 3 .3 ) 8 2 ( 5 9 .9 ) b 5 9 ( 8 3 . 1 ) 8 0 ( 7 8 .4 ) 注: P 0 .0 5 , 同 列不同 字母间比 较, c o m p e r e d w it h d i f f e r e n t le tt e r a t t h e s a m e c o lu m n 细胞分
20、裂周期基因的蛋白产物 ( c d c 2 )结合而 成, 其激活必须有新蛋白 质的合成和c d c 2 依次的 磷酸化及去磷酸化过程。 B L - I 是一种嚓吟类的衍生 物, 它主要抑制c d c 2 , c d k 2 和c d c 5 0 1 o B L - I 抑 制MP F 机理在于它能和A T P 竞争性结合c d c 2 ,从 而阻止c d c 2 的去磷酸化过程,使MP F 不能激活, 卵母细胞不能恢复减数分裂,保持在停滞状态2 ,3 1 0 研究显示4 , B L - I 在抑制MP F的同时, 对细胞内 的其它重要激酶 ,如丝裂 原活化蛋 白激酶 ( MA P K) 、蛋白
21、 激酶C等影响较小。因此, B L - I 在抑制核成熟时, 对细胞的正常生理活动如蛋白 质 合成及修饰,磷酸化等影响也较小,有利于细胞 质的发育,这是我们选择B L - I 作为成熟抑制剂进 行研究的原因。 本研究结果显示, B L - I 能可逆性抑制小鼠 未 成熟卵的核成熟,且不影响其成熟能力。这与对 牛、猪未成熟卵的研究相一致3 ,6 。然而,对牛、 猪而言,由于未成熟卵在体外培养达到成熟需4 8 h 左右,其核成熟抑制时间多在2 4 h 左右。而小鼠 经P MS G作用4 8 h 的未成熟卵,在体外培养3 h , 一半以上的卵母细胞发生G V B D;到 1 6 h ,绝大 - 3
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