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1、文章编号: 1 0 0 1 - 4 8 2 9(2 0 0 6)0 2 - 0 2 9 4 - 0 3 收稿日期: 2 0 0 5 - 0 8 - 1 7 作者简介: 余瑛 (1 9 6 9 -) , 女, 博士, 副教授, 主要从事生物医 学工程研究。 不同乳杆菌对常见病原菌的抑菌效果研究 余瑛, 张娅, 刘锐, 曾丹, 黄玮, 姜和 (重庆工学院生物工程学院, 重庆 4 0 0 0 5 0) 摘要: 对不同来源的乳杆菌的抑菌作用进行了研究。采用纸片琼脂扩散法研究了嗜酸乳杆菌, 干酪乳杆菌, 德氏保加利亚乳杆 菌代谢产物对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌的拮抗效果。结果表明供试乳杆菌
2、的表达产物对大肠杆菌、 金黄色葡萄球 菌均有明显拮抗作用, 抑菌环直径达到1 . 6 2 . 1c m; 对白色念珠菌的拮抗作用相对较弱, 抑菌环直径仅1 . 11 . 4c m。不同p H 生长测试结果表明, 白色念珠菌比大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌耐酸能力强, 对乳杆菌表达的乳酸有一定的拮抗作用。 关键词: 乳杆菌; 抑菌活性; 病源菌; 琼脂扩散法 中图分类号: Q 9 3 9 . 1 1 7 文献标识码: A S t u d i e s o n t h e a n t a g o n i s t i cp r o p e r t yo fl a c t o b a c i l l u s
3、 Y UY i n g,Z H A N GY a,L I UR u i , Z E N GD a n,H U A N GW e i,J I A N GH e (C o l l e g e o fB i o e n g i n e e r i n g, C h o n g q i n g I n s t i t u t e o fT e c h n o l o g y,C h o n g q i n g4 0 0 0 5 0C h i n a) A b s t r a c t:T h e a n t a g o n i s t i cp r o p e r t yo fL a c t o b a
4、 c i l l u sf r o md i f f e r e n t r e s o u r c e sw e r e s t u d i e d . T h e a n t a g o n i s t i c p r o p e r t y o fL.a c i d o p h i l u s, L.c a s e ia n dL.b u l g a r i c u sw e r ee v a l u a t e db ya g a rd i f f u s i o nt e s t s .A l lo fL a c t o b a c i l l u sh a do b v i o u
5、 sa n t a g o n i s t i ca c t i v i t yo nt h e p a t h o g e n i cE.c o l ia n dS.a u r e u s,b u t l o wa n t a g o n i s t i c a c t i v i t y o nC. a k b u c a b s. T h e s i z e o f t h e i n h i b i t i o n z o n e a r o u n d t h e p r o d u c t i o n s o f l a c t o b a c i l l u si nE.c o
6、l ia n dS.a u r e u sd i s kw e r e o b s e r v e d f r o m1 . 6 c mt o 2 . 1 c m,a n d t h e s i z e o f t h e i n h i b i t i o n z o n e a r o u n d t h e p r o d u c - t i o n s o fl a c t o b a c i l l u si nC.a k b u c a b sd i s kw e r eo b s e r v e d f r o m1 . 1c mt o1 . 4c m .C.a k b u c
7、a b sc o u l dg r o wi n l o w e rp Hm e d i u mt h a n E.c o l ia n dS.a u r e u sw h i c hm a d e i tm o r e c h a n c e t o s u r v i v el a c t o b a c i l l u si na c e r t a i ne x t e n t . K e yw o r d s:L a c t o b a c i l l u s;a n t a g o n i s t i c a c t i v i t y 乳杆菌在自然界分布较广。有的生活在口腔、 胃
8、、 肠道, 是人体重要的益生菌, 有的生存在乳、 乳制 品或水果、 蔬菜等植物制品上。乳杆菌具有辅助机 体消化、 促进营养物质吸收、 抑制某些病原菌、 提高 机体防病能力等作用 1 。近年来的研究认为, 乳杆 菌能产生乳酸、 双氧水、 细菌素、 类细菌素等生物活 性物质, 对于维持肠道、 阴道微生态平衡, 预防病源 菌感染具有重要作用。不同来源的乳杆菌, 由于其 生存环境的差异, 某些特性可能不同。比较研究不 同来源的乳杆菌对常见病原菌的拮抗效果, 将为乳 杆菌的合理开发与利用提供参考。 本试验以人体来源的嗜酸乳杆菌, 乳制品来源 的干酪乳杆菌和植物来源的德氏乳杆菌为研究对 象, 分别研究比较
9、了其生长特性和对常见病原菌大 肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌的拮抗作用, 以期为乳杆菌的开发利用提供依据。 1 材料与方法 1 . 1 供试材料 菌种: 乳杆菌共4株: 嗜酸乳杆菌 (L.a c i - d o p h i l u s) , 干酪乳杆菌 (L.c a s e i) , 德氏保加利亚乳 杆菌1,德氏保加利亚乳杆菌 (L.b u l g a r i c u s) 2, 均 购自中科院微生物所。大肠杆菌 (E.c o l i) 、 金黄色 葡萄球菌 (S. a u r e u s) 、 白色念珠菌 (C.a k b u c a b s) 由 本实验室保藏。 培养基: 乳杆菌培
10、养采用MR S培养基。大肠 杆菌、 金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌培养采用L B培 养基。 1 . 2 试验方法 1 . 2 . 1 乳杆菌的生长特性试验 4种乳杆菌连续 传代3次后, 取单菌落接种MR S, 培养3 6h。将上 述培养液用1 0倍稀释法稀释至1 0 - 7,取1 0- 5、 1 0 - 6、 1 0 - 7 3个稀释度菌液分别涂布于 p H 值为 492 西南农业学报 S o u t h w e s tC h i n a J o u r n a l o fA g r i c u l t u r a l S c i e n c e s 2 0 0 6年1 9卷2期 V o l .
11、 1 9N o . 2 1 .L.b u l g a r i c u s1上清;2 .L.c a s e i表达上清;3 .L.b u l g a r i c u s2 表达上清; 4 .L.a c i d o p h i l u s表达上清;5 .E.c o l i 图1乳杆菌对大肠杆菌的拮抗作用 F i g . 1 T h e a n t a g o n i s t i c f u c t i o no fL a c t o b a c i l l u so nE.c o l i 1 .L.b u l g a r i c u s1上清;2 .L.c a s e i表达上清;3 .L.b u
12、 l g a r i c u s2 表达上清; 4 .L.a c i d o p h i l u s表达上清;5 .S.a u r e u s 图2乳杆菌对金黄色葡萄球菌的拮抗作用 F i g . 2 T h e a n t a g o n i s t i c f u c t i o no fL a c t o b a c i l l u so nS.a u r e u s 6 . 8、6 . 0、5 . 0、4 . 0的MR S培养基平板上,各重复3 次,3 7恒温培养4 8h,观察乳杆菌菌在不同 p H 下的生长情况。 将上述平板上长出的典型单菌落转移至1 0% 脱脂牛乳培养基中,3 7培
13、养1 2 2 4h, 记录脱脂 牛乳的凝乳速度以及 p H 值的变化。 1 . 2 . 2 供试乳杆菌对常见病原菌的抑菌效果试验 本试验采用纸片扩散法 2 。取供试乳杆菌单菌 落接种MR S, 培养3 6h。培养液经4 0 0 0rm i n离 心后, 取上清过滤灭菌, 备用。 将活化后的大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 白色念 珠菌分别接种L B, 3 7 培养1 2h。将各培养液 O D6 0 0调整为0 . 3, 分别取1 0 0l接种于L B平板, 涂 布均匀, 固定1h后, 放入灭菌滤纸圆片。取过滤灭 菌的乳杆菌培养上清5 0 l滴加到滤纸圆片上。平 板置于3 7培养1 2h, 测量抑菌
14、环直径。 1 . 2 . 3 p H值对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 白色念 珠菌生长的影响试验分别挑取大肠杆菌、 金黄色 葡萄球菌、 白色念珠菌的单菌落接种L B, 3 7过夜 培养。将过夜培养物分别调整至O D 6 0 0E0 . 4 , 各取 1 0 0l分别接种p H7 . 0、p H6 . 0、p H5 . 0、p H4 . 0 (用 乳酸调节 p H 值) , 体积为1 0 0m L的L B。 置3 7 1 .L.b u l g a r i c u s1上清;2 .L.c a s e i表达上清;3 .L.b u l g a r i c u s2 表达上清; 4 .L.a c i
15、d o p h i l u s表达上清;5 .S.a u r e u s 图3乳杆菌对白色念珠菌的拮抗作用 F i g . 3 T h e a n t a g o n i s t i c f u c t i o no fL a c t o b a c i l l u so nC.a k b u c a b s. 培养6h, 测O D 6 0 0值。 2 结果与分析 2 . 1 乳杆菌的生长特性 4株乳杆菌在MR S培养基上均能生长。其中, 德氏保加利亚乳杆菌2, 嗜酸乳杆菌, 干酪乳杆菌菌 落形态均为圆形, 白色, 凸起, 光滑, 边缘整齐。德氏 保加利亚乳杆菌1菌落近圆形, 灰白色, 粗糙,
16、 边缘 不整齐。 4株乳杆菌同一稀释度的菌液均在p H6 . 0的 培养基上菌落数最多, 菌落直径最大。其中嗜酸乳 杆菌, 生长最好, 德氏保加利亚乳杆菌2次之, 德氏 保加利亚乳杆菌1最差。 表1乳杆菌对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 白色念珠 菌的拮抗作用 T a b l e 1T h eL a c t o b a c i l l u s s i n h i b i t i o ne f f e c to nt h ep a t h o g e n i c E.c o l i,S.a u r e u sa n dC.a k b u c a b s 乳杆菌 拮抗菌 L a c t o b a
17、c i l l u sT h e s u p p r e s s e d p a t h o g e n i c g e r m s 抑菌环平均直径 (c m) T h e s i z e o f a n t a g o n i s t i c a v e r a g ed i s c s 德氏保加利亚乳杆菌1 大肠杆菌 1 . 9 德氏保加利亚乳杆菌1 金黄色葡萄球菌 1 . 6 德氏保加利亚乳杆菌1 白色念珠菌 1 . 1 干酪乳杆菌 大肠杆菌 1 . 9 干酪乳杆菌 金黄色葡萄球菌 1 . 6 干酪乳杆菌 白色念珠菌 1 . 4 德氏保加利亚乳杆菌2 大肠杆菌 2 . 1 德氏保加利亚乳
18、杆菌2 金黄色葡萄球菌 1 . 8 德氏保加利亚乳杆菌2 白色念珠菌 1 . 1 嗜酸乳杆菌 大肠杆菌 2 . 1 嗜酸乳杆菌 金黄色葡萄球菌 2 . 1 嗜酸乳杆菌 白色念珠菌 1 . 2 5922期 余瑛等: 不同乳杆菌对常见病原菌的抑菌效果研究 表2不同 p H 值培养液中大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌的生长情况 T a b l e2T h eO D6 0 0o fE.c o l i,S.a u r e u sa n dC.a k b u c a b s g r o w t h i nd i f f e r e n t p Hm e d i u m 拮抗菌 P a t h o
19、g e n i c g e r m s 在不同p H值培养液中 培养6h后拮抗菌的O D 6 0 0值 T h eO D6 0 0o f p a t h o g e n i c g e r m s g r o w t h i nd i f f e r e n t p Hm e d i u ma f t e r 6h p H 7 . 0p H6 . 0 p H5 . 0p H4 . 0 金黄色葡萄球菌 1 . 4 6 20 . 0 4 60 . 0 4 50 . 0 3 4 大肠杆菌 1 . 4 7 61 . 3 2 10 . 0 4 80 . 0 3 9 白色念珠菌 1 . 5 4 41 .
20、5 4 10 . 3 8 60 . 0 7 5 单菌落转移至1 0%脱脂牛乳培养基中, 3 7恒温 培养,以德氏保加利亚乳杆菌1和干酪乳杆菌凝乳 最快 (约1 2h) , 其次为嗜酸乳杆菌和德氏保加利亚 乳杆菌2(约1 8h) 。凝乳时其脱脂乳的 p H 值分别 为: 德氏保加利亚乳杆菌1, p H4 . 0 0; 干酪乳杆菌, p H4 . 4 4; 嗜酸乳杆菌, p H4 . 0 2; 德氏保加利亚乳杆 菌2, p H4 . 5 4。 2 . 2 供试乳杆菌对常见病原菌的抑菌效果 2 . 2 . 1 乳杆菌对大肠杆菌的拮抗作用从图1、 表 1可以看出4株乳杆菌对大肠杆菌都均有很好的抑 菌效
21、果, 抑菌环直径为1 . 9 2 . 1c m。其中, 德氏保 加利亚乳杆菌2和嗜酸乳杆菌对大肠杆菌的拮抗作 用最强, 达到2 . 1c m。 2 . 2 . 2 乳杆菌对金黄色葡萄球菌的拮抗作用从 图2、 表1可以看出, 4株乳杆菌对金黄色葡萄球菌 也有明显的抑菌效果, 抑菌环直径为1 . 6 2 . 1c m。 其中, 嗜酸乳杆菌对金黄色葡萄球菌的拮抗作用最 强, 抑菌环直径达到2 . 1c m; 德氏保加利亚乳杆菌2 次之, 为1 . 8c m。 2 . 2 . 3 乳杆菌对白色念珠菌的拮抗作用从图3、 表1可见, 4株乳杆菌对白色念珠菌都有拮抗作用, 但效果远不如对大肠杆菌和金黄色葡萄
22、球菌的拮抗 作用明显, 抑菌环直径仅为1 . 1 1 . 4c m。其中, 干 酪乳杆菌的抑菌作用较为明显,抑菌环直径为1 . 4 c m。 此外, 在4株乳杆菌的抑菌圈内部仍有明显可 见的菌落生成。这一现象暗示, 4株乳杆菌的表达 产物中可能还含有利于白色念珠菌生长的成分。 2 . 3 不同 p H 值对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 白 色念珠菌生长的影响 3种病原菌对培养液 p H 值的敏感程度为: 金黄 色葡萄球菌大肠杆菌白色念珠菌 (表2) 。 p H 值在4 . 5 5 . 0左右, 大肠杆菌和金黄色葡 萄球菌的生长几乎完全被抑制, 但白色念珠菌较耐 酸, 仍有一定程度的增殖。4株乳
23、杆菌对白色念珠 菌的拮抗效果不如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌明 显, 可能在很大程度上与白色念珠菌具有较强的耐 酸性有关。 3 讨论 乳杆菌应用于生物活性食品开发,不但具有较 高的营养价值,而且还具有一定的医疗价值,其医 疗价值可以明显地从图13和表1中对常见病原 菌的抑制作用看出。同时,研究结果还表明,不同 菌种甚至同一菌种不同菌株的乳杆菌抑菌作用存在 差异。乳杆菌的抑菌机制可能涉及多种抑菌成分, 但对不同病原菌的抑菌作用机理还无定论 3 。本 文涉及的3种乳杆菌 嗜酸乳杆菌, 干酪乳杆菌, 德氏保加利亚乳杆菌, 其抑菌成分是否相同, 抑菌机 理如何, 值得进一步研究。乳杆菌在生长过程中大 量表
24、达乳酸, 使人体内酸性环境得以维持,对人类 抵抗病原菌侵染和抗病毒十分重要。有关研究发 现, 正常的女性阴道, p H 值在4 . 55 . 0左右, 往往 以乳杆菌作为优势菌群, 这样的酸性环境不仅能杀 灭病原细菌, 还能有效抵抗H I V的入侵。相反, 乳 杆菌菌群被破环后, 细菌菌群成为优势菌群, 阴道 p H 值提高, 则有利于H I V等病毒和其它病原菌的 侵染 4 5 , 这种人群感染H I V的风险性大大高于前 者。如果能及时补充受损的乳杆菌, 恢复阴道的正 常酸性环境, 将对保护妇女生殖健康, 提高妇女的生 存质量起到积极的作用。当然, 要想获得具有优良 抑菌特性的乳杆菌, 仍
25、然有许多工作要做。 参考文献: 1 C a s a s IA,D o b r o g o s zWJ . V a l i d a t i o no f t h e p r o b i o t i c c o n c e p t:L a c - t o b a c i l l u s r e u t e r ic o n f e r sb r o a d - s p e c t r u mp r o t e c t i o na g a i n s td i s e a s e i nh u m a n s a n d a n i m a l s J .M i c r o b i a l .E
26、c o l .H e a l t hD i s .,2 0 0 0,1 2: 2 4 7 -2 8 5 . 2 刘志恒.现代微生物学 M .北京: 科学出版社,2 0 0 3 . 3 李铁军, 李爱云, 张晓峰.乳酸菌抗菌机理研究进展 J .微生物 学通报, 2 0 0 2,2 9:8 1 - 8 5 . 4M a r aS i l v i n aJ u r e zT o m s,V i r g i n i aS .O c a U a,V i r g i t tW i e s e,e t a l . W r o w t ha n dl a c t i ca c i dp r o d u c t
27、 i o nb Xv a g i n a lL a c t o b a c i l l u sa c i - d o p h i l u sC Y Z1 2 5 9,a n di n h i b i t i o no fu r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i a c o l i J .M e d .M i c r o b i o l .,2 0 0 3,5 2:1 1 1 7 - 1 1 2 4 . 5 P o l l X . H a r r i s o n, e d aY o s e n b e r g,J a n aV o w c u t .T o p i c a lM i c r o b i - c i d e sf o rD i s e a s eP r e v e n t i o n:S t a t u sa n dC h a l l e n g e s J. H I V A I D S .C I D,2 0 0 3,3 6:1 2 9 2 - 1 2 9 4 . (责任编辑李正华) 692 西南农业学报 1 9卷
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