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1、不同培养液及不同培养时间对犬卵母 细胞体外成熟的影响 贾丽玲1, 刘国世1*, 张洪海2, 马承宝1, 麻武仁3 (1.中国农业大学动物科技学院, 北京100094; 2.曲阜师范大学生物系, 山东曲阜273165;3.中国农业大学动物医学院, 北京 100094) 摘要: 试验采集犬卵巢, 用切割法回收卵泡中的卵母细胞, 选取胞质均匀、 2 层或 2 层以上颗粒细胞、 直径 110m的卵母细胞移入不同的培养液中:(A) M199 + 10% FBS + 0.5g/ mL FSH + 10 IU/ mL hCG,(B) M199 + 0.1% PVA 进行体外成熟培养。在培养不同时间 (0,
2、48, 72 h) 用 1% 醋酸地衣红染色, 在显微镜下观察卵母细胞核成熟情 况, 探索适宜犬卵母细胞体外成熟的培养体系。结果表明: 卵母细胞在 A 液中培养 48 h MII 期比例 (7.84%) 高于 B 液中的比例 (P 0.05) , 但 72 h 卵母细胞退化比例高于 48 h (P 0.05) ; GVBD 期 也 是 A 液 中 的 比 例 较 高 62.75% (P 0.05) , MI 期卵母细胞在 A 液中培养的比 例较高, 为 28.00% ( P 0. 05) ; 培养 48, 72 h MI 比例分别为 23.53%和 28.00% (P 0.05) 。 表 3
3、在 A 液中不同培养时间对犬卵母细胞体外成熟各阶段发育率的影响 时间 / h 卵数 / 个 各发育阶段卵数及百分率 / % DSGVGVBDMIMIID 03028 (94.00) A 2 (6.00) A 0A0A0A0A 48513 (5.88) B 12 (23.53) A 32 (62.75) B 12 (23.53) B 4 (7.84) B 0A 72503 (6.00) B 3 (6.00) B 13 (26.00) C 14 (28.00) B 4 (8.00) B 13 (26.00) B 由此可见, 犬的卵母细胞体外成熟过程中, 培养 48, 72 h MII 期比例无显著
4、差异, 72 h 出现退化现象。 综上所述, 犬卵母细胞在上述两种培养液中体 外成熟培养, 较好成熟培养液为 A 液,且培养 48 h 为较好成熟时间。 3讨论 本试验 (A) M199 + 10% FBS + 0.5g/ mL FSH + 10 IU/ mL hCG 中培养的效果比 (B)M199 + 0. 1% PVA 效果好。说明在加有 FBS 和 FSH、 hCG 对犬的 卵母 细 胞 体 外 成 熟 有 促 进 作 用, 这 与 Hewitt 等 (1998) 4认为加有 10% FBS 比 5% FBS 有利于犬卵 母细胞达 MII 结论相似, 但浓度大于 10% 时仅对犬 卵母细
5、胞维持生存有作用, 而对成熟没有任何的促 进作 用; Monica 等 (2005) 5报 道, 在 基 础 培 养 液 (M199) 中加入 10 IU/ mL hCG 培养, 培养相同时间, 卵母细胞成熟明显好于未加组, 认为 hCG 有利于颗 粒细胞与卵母细胞间的缝隙链接 (GJ) , 而 GJ 参与了 卵母细胞的减速分裂及进一步发育的调控, 从而促 进卵母细胞成熟。本试验中加入 FSH, FSH 在其他 动物 上 已 经 证 明 能 在 体 外 调 控 卵 丘-卵 母 细 胞 (COCs) 中 cAMP 水平, 有利于颗粒细胞的扩散, 而且 对卵母细胞进行减数分裂有促进的作用 5。但与
6、之 相反, Hewitt 等 (1999) 6、 Songsasen 等 (2002)7认为 FSH/ LH (1g/ mL) 单独或一起加入培养液与颗粒细 胞的扩展成负相关, 添加二者对提高卵母细胞成熟 率没有显著的促进作用。 目前, 犬的体外成熟低主要还是缺乏对犬体内的 受精过程精确的认识及难以模仿体内环境, 还没有找 到适合犬卵母细胞体外成熟的专门的培养体系。 参考文献: 1 Wildt D E,Chakraborry P K,Panko W B,et al . Relation- ship of reproductive behavior,serum luteinizing hormo
7、ne and the time of ovulation in the bitch J . Biol Reprod,1978, 18:561-570. 2 Renton J P,Boyd J S,Eckersall P D,et al . Ovulation,fer- tilization and early embryonic development in the bitch(Canis familiaris) J . Reprod Fertil,1991,93:221-231. 3 Yamada S,Shimazu Y,Kawano Y,et al . In vitro maturatio
8、n and fertilization of preovulatory dog oocytes J . Reprod Fer- til,1993,47 (Suppl.) :227-229. 4 Hewitt D A,Watson P F,England G C W. Nuclear staining and culture requirements for in vitro maturation of domestic bitch oocytes J . Theriogenology,1998,49:1083-1101. 5 Monica De los Reyesa,Johanna de La
9、ngea,Pedro Mirandaa, et al . Effect of human chorionic gonadotrophin supplementa- tion during different culture periods on in vitro maturation of canine oocytes J . Theriogenology,2005,64:1-11. 6Hewitt D A,England G C W. Influence of gonadotrophin supplementation on the in vitro maturation of bitch oocytes J . Vet Rec,1999,144:237-239. 7 Songsasen N,Yu I,Leibo S P. Nuclear maturation of canine oocytes cultured in protein-free media J . Mol Reprod Dev, 2002,62:407-415. 72 中国畜牧杂志2005 年第 41 卷第 12 期试试试试 试试试试试试试试 验验验验验验验验验验验验 研研研研研研研研研研研研 究究究究究究究究究究 究究
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