下肢缺血及GCSF促进小鼠外周血内皮祖细胞动员.pdf
《下肢缺血及GCSF促进小鼠外周血内皮祖细胞动员.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《下肢缺血及GCSF促进小鼠外周血内皮祖细胞动员.pdf(4页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、中国病理生理杂志2 1 ( 1 1 ) 2 1 3 2 2 1 2 9 文章编号 1 0 0 ( 一 4 7 1 8 ( 2 0 0 5 ) 1 1 一 2 1 2 9 一 0 4 下肢缺血及 G一C S F促进小鼠外周 血内皮祖细胞动员关 周音频, 黄岚 , 宋耀明, 晋军, 武晓静, 崔斌 ( 第三军医大学新桥医院全军心血管内科中心, 重庆4 0 0 0 3 7 ) 摘要 目的: 观察下肢缺血以及腹腔注射粒细胞集落刺激因子( G - C S F ) 对小鼠外周血内皮祖细胞( E P C s ) 的影响。 方法: 建立小鼠下肢缺血模型, 双色荧光标记流式细胞技术检测缺血状态下外周血内皮祖细胞
2、的变化, 同 时给予G 一 C S F 后观察对 E P C s 的影响。 结果: 下肢缺血后, 外周血中反映 E P C s 变化的C D 3 4 和V E G F R 2 双荧光阳性 细胞比例轻度增加, 在缺血基础上同时给予 G - C S F , 上述变化更明显。 结论: 下肢缺血刺激可以使外周血内皮祖细 胞数量增加, G - C S F 通过骨髓动员可增强这种效应。 关键词 缺血; 粒细胞集落刺激因子; 内皮祖细胞 【 中图分类号 8 3 6 3 文献标识码 A H i n d l i m b i s c h e m i a a n d g r a n u l o c y t e c
3、o l o n y一s t i m u l a t i n g f a c t o r a c c e l e r a t e s m o b i l i z a t i o n o f e n d o t h e l i a l p r o g e n i t o r c e ll s i n m i c e p e r i p h e r a l b l o o d Z H O U Y i n 一 p i n , H U A N G L a n , S O N G Y a o 一 m i n g , J I N J u n , WU X i a o 一 j i n g , C U I B
4、i n ( D e p a r tm e n t of C a r d io l o g y , X in q ia o H o sp i t a l , T h i r d M i l it a r y M e d ic a l U n iv e r s ity , C h o n g q i n g 4 0 0 0 3 7 , C h i n a ) 仁 A B S T R A C T A I M: T o e v a lu a t e t h e m o b il i z a t i o n o f e n d o t h e l i a l p r o g e n it o r c e
5、 ll s ( E P C s ) i n m ic e p e r i p h e r a l b l o o d d u r in g h i n d l i m b i s c h e m ia a lo n e o r i n c o m b in a t i o n w it h g r a n u l o c y te c o l o n y s t i m u la ti n g f a c t o r ( G 一 C S F ) . ME T H O D S ; I-I in d l im b i s c h e m ia w a s e s t a b l is h e d
6、in m ic e 场s u r g ic a l e x c i s io n o f b o t h f e m o r a l a rt e r i e s . F lu o r e s c e n c e 一 a c t iv a t e d c e ll s o r ti n g ( F A C S ) w a s u s e d t o d e - t e c t t h e e x p r e s s i o n o f c e l l 一 s u r f a c e C D 3 4 a n d v a s c u l a r e n d o th e li a l g r o
7、w th f a c to r r e c e p t e r 一 2 ( V E G F R 2 ) a n t i g e n s . T h e r a t io o f d o u - b l e 一 p o s i t i v e c e ll s f o r C D 3 4 a n d V E G F R 2 w a s r e g a r d e d a s t h e l e v e l o f E P C s i n p e r i p h e r a l b l o o d . I n G 一 C S F a d m i n i s t r a t i o n i n c
8、o m - b i n a t io n w i t h h i n d l i m b i s c h e m i a g r o u p , t h e p e r c e n t a g e o f d o u b l e 一 p o s i t i v e c e l l s w a s a l s o d e t e c t e d . R E S U L T S ; A s c o m p a r e d w i t h c o n t ro l g ro u p , h i n d l i m b i s c h e r n i a i n c r e a s e d t h e
9、 p e r c e n t a g e o f E P C s i n 而c e p e r i p h e r a l b l o o d 厂 Me h i n d l i m b i s c h e r n i a c o m b i n e d w i t h G 一 C S F a d m i n i s tr a t i o n s i g n i f i c a n t l y e n h a n c e d t h e p e r c e n t a g e o f E P C s . C O N C L U S I O N : I s c h e m i a i n c re
10、 a s e s t h e n u m b e r o f E P C i n p e r i p h e r a l b l o o d . I t m a y in d u c e th e m ig r a t i o n o f E P C f ro m b a r ro w t o p e r i p h e r a l b lo o d . B y m o b i l iz in g b a r r o w , G 一 C S F e n h a n c e s th i s e ff e c t . K E Y W O R D S I s c h e m i a ; G r a
11、 n u lo c y t e c o lo n y 一 s t i m u l a t i n g f a c to r ; E n d o t h e l i a l p ro g e n it o r c e ll s 在动脉粥样硬化及介人治疗后引起的血管再狭 窄过程中, 均存在血管壁内皮细胞的损伤和再内皮 化过程障碍等共同的病理生理过程。深人研究内皮 损伤后的修复过程, 对防治动脉粥样硬化及介人治 疗后的 再狭窄有重要意义。有研究表明 口 , 在烧伤 和冠状动脉搭桥术中, 外周血骨髓来源的内皮祖细 胞( e n d o t h e l i a l p ro g e n it o r c
12、 e ll s , E P C s ) 数量明显增加, 并与血中血管内皮细胞生长因子水平变化明显相 关, 可能与血管内皮的修复过程增强有关。A s a h a r a 等 2 将转基因小鼠的骨髓移植到肢体缺血的小鼠 体 内, 发现在缺血局部组织有骨髓来源的E P C 参与血 管再生过程。本实验在建立小鼠肢体缺血模型的基 础上, 观察缺血因素及粒细胞集落刺激因子对外周 血E P C 的影响, 为进一步探讨外周血E P C 变化对损 伤血管修复过程提供研究基础。 材料和方法 1 材料 P E 标记的抗小鼠血管内皮生长因子受体 2 ( v a s - c u l a r e n d o t h e
13、l i a l g ro w t h f a c t o r re c e p t o r 一 2 , V E G F R 2 ) 单 克 隆 抗体 和I g G 2 。 同 型 对照 抗体( e B io s c ie n c e 公司); F I T C 标记的抗小鼠白细胞分化抗原3 4 ( c l u s t e r o f d i f - fe re n t ia tio n , C D 3 4 ) 单克隆 抗 体和I g G 2 。 同 型 对 照 抗 体 ( S e ro t e c 公司) ; 红细胞裂解液( B D公司) ; 重组人粒 细胞集落刺激因子r h G 一 C S F
14、 , 商品名瑞血新( 深圳新 鹏生物工程有限公司) ; 流式细胞检测仪( B D公司) 。 收稿日 期 2 0 0 4 - 0 3 - 0 9 修回日 期 2 0 0 4 - 0 5 - 2 5 基金项目 国家自 然科学基金资助课题( N o . 3 0 2 7 0 5 6 8 ) 通讯作者T e l : 0 2 3 一 6 8 7 5 5 6 1 4 ; E 一 。1 : h u a n g la n s 2 1 e n . c o rn 2 1 3 0 十闪国0国净+寸仍口口 2 小鼠肢体缺血模型制备 B A L B / C 小鼠 共8 8 只, 体重3 0 一 4 0 g , 雌雄不拘
15、( 第三军医大学动物中 心提供) , 参考C o u f f i n h a l 等 3 的方法复制小鼠双下肢缺血模型。术后随机分为两 组, 各犯只, 组C ( 缺血加细胞因子组) 从术后即刻开 始 腹腔注 射r h G 一 C S F 1 0 0 ji g / k g , 每天1 次, 直至取 标本时为止; 组 B ( 缺血组) 给予等量的生理盐水, 同 时设2 4只未手术小鼠为对照组( A组) 。设置术前 1 d , 术后1 , 3 和7 d 共4 个时点, 各组在对应的时点 分别取8 只小鼠 分离左侧颈总动脉各取血1 一 2 m L , 肝素抗凝, 分别行白细胞计数和双色荧光标记 ( C
16、 D 3 4 十 V E G F R 2 ) 流式细胞检测。 3 周围血白细胞总数检测 采用自 动血细胞计数仪进行。 4 双色荧光标记流式细胞检测方法 采用全血法。具体步骤: ( 1 ) 每只小鼠各设置 1 个测定管及同型对照管, 每管取肝素抗凝全血 0 . 1 m L ; ( 2 ) 测定管加P E 标记的抗小鼠V E G F R 2 的单 抗和F I T C 标记的 抗小鼠C D 3 4 单抗各2 0 t A g , 同型对 照管加相应的两种同型对照抗体, 4避光孵育 3 0 m i n ; ( 3 ) 每管加2 m L 红细胞裂解液, 3 7避光孵 育1 0 m i n ; W l 5
17、0 0 r / m i n 离心5 m i n , 弃上清; ( 5 ) 流式 细胞检测缓冲液( 含0 . 0 1 m o l / L 磷酸缓冲液、 0 . 5 % 牛血清白蛋白、 0 . 0 5 %叠氮钠) 洗涤 2 次; ( 6 ) 加 1 % 多聚甲 醛3 0 0 t .L 重悬, 上机检测。以4 8 8 r u n 氢离子 激光激发, 每次计数1 0 0 0 ( 个细胞, 用C e l l q u e s t 计算 机软件分析双荧光阳性细胞所占比例, 每个标本中 测定管的双荧光阳性细胞比例减去对照管的双荧光 阳性细胞比例, 为该标本中实际的双荧光阳性细胞 比例。 5 统计学处理 计量数
18、据以均数士 标准差( 无 土、 ) 表示, 两组间 数据差异用 t 检验。统计学分析采用S P S S 1 0 . 0 统 计软件进行。 3 双荧光阳性细胞比例 对照组在4 个时点以及3 组术前的C D 3 4 + V E G - F R 2 + 双荧光阳性细胞比例均无显著差异。术后 1 , 3 和7 d , 缺血组C D 3 4 + V E G F R 2 + 双荧光阳性细胞比例 均较对照组增加; 在缺血加细胞因子组, 双荧光阳性 细胞比例较单纯缺血组增加更明显( 见表2 、 图1 ) 0 4 流式细胞检测的二维点阵图 各组在术后7d 进行流式细胞检测的二维点阵 图见图2 ( A : 对照组
19、; B : 缺血组; C : 缺血加细胞因子 组) , 其右上象限代表 C D 3 4 和 V E G F R 2 双荧光阳性 细胞所占的比例, 图中可见 B , C两组双荧光阳性细 胞所占 点阵的比例大于对照组, 其中缺血加细胞因 子组更为明显。 -* - Co n t r o l t s c h e mi a 一 今 一G一 CSF * OCt了曰、.得气j,110 Be f o r e o p e r a t i o n 1 d 3 d 7 d F i g 1 图 1 n g e s o f d o u b l e p o s i p e r i p h e r a l b l o o
20、d C ht i v e e x p r e s si o nc e l l s % .1 日 川lo f t h r e e i s c h e mi a a n d g rou p s . o n d i ff e r e n t t i me x 士 s .C o n t rol g r o i 甲 n= 8 n=6 ;i s c h e m i a p l u s G一C S F g r o u p s , .P0 . 0 5 v s c o n t ro l g r o u p ;尸0 . 0 5 v s i s - c h e m i a g ro u p . 3 组不同时点双荧光
21、阳性细胞变化趋势图 讨论 结果 1 小鼠下肢缺血模型建立情况 分离、 结扎和切断下肢血管的效果明显。术后 缺血组及缺血加细胞因子组分别在术后第 1 d 各有 1 只小鼠死亡, 未手术组均存活。手术后的小鼠均有 不同程度的下肢活动障碍, 部分有下肢坏死。 2 外周血白细胞总数的测定 对照组各时点白细胞总数无显著差异, 缺血组 及缺血加细胞因子组术前的白细胞总数与对照组比 较, 也无显著差异。术后 1 , 3 和7 d , 缺血组外周血白 细胞总数显著高于对照组, 缺血加细胞因子组较单 纯缺血组增加更为明显( 见表 1 ) 0 E P C s 是成熟血管内皮细胞的前体细胞, 属于干 细胞群体, 既
22、可不断增殖, 又能定向分化为成熟的内 皮细胞, 但尚未表达某些成熟血管内皮细胞的表型。 C D 3 4 是造血干细胞的主要表面标志之一, 同时存在 于胚胎早期的血管上; V E G F R 2 ( 小鼠也称 F l k 一1 ) 是 血管系统最早出现的细胞标记, 也是鉴定 E P C的分 子标志之一 4 1 。 胚胎干细胞来源的F l k 一 1 阳 性细胞 可以 分化形成血管内 皮细胞和血管结构 5 , 提示其 中 含有 E P C s 。外周血中存在 E P C s , 同时表达 C D 3 4 和V E G F R 2 细胞表面标志的前体细胞, 经培养后可 表达成熟内 皮细胞的表面标志
23、6 , 所以 认为同时表 达C D 3 4和V E G F R 2 表面标志的前体细胞可代表 E P C s 的变化水平。 在骨髓移植模型犬的主动脉中植人人造涤纶织 物, 发现骨髓来源的C D 3 4阳性细胞可分化为内皮细 胞 7 , 但外周 血中E P C s 具体水平以 及与 分化的内 皮 细胞之间的关系尚不明确。缺血预适应可以促发心 肌侧枝循环形成和毛细血管功能性开放, 其中的机 理以及与外周血中E P C s 水平的关系没有作进一步 2 1 3 1 表 1 3 组不同时点外周血白细胞总数 T a b 1 WB C c o u n t s o n d iff e r e n t t i
24、m e i n p e r i p h e r a l b l o o d o f t h r e e g r o u p s ( x 1 护 / L O p e r a t i o n 3 d . 无土、 ) B e f o r e o p e r a t i o n C o n t r o l ( n = 6 ) 5 . 6 7 士 0 . 6 8 I s c h e m i a ( n = 8 ) 6 . 0 5 1 0 . 2 4 I s c h e m i a + G 一 C S F ( n = 8 ) 6 . 2 3 1 0 . 4 2 “ P 0 . 0 5 v s c o n
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 下肢 缺血 GCSF 促进 小鼠 外周血 内皮 细胞 动员
链接地址:https://www.31doc.com/p-3697450.html