《不同成熟状态小鼠树突状细胞的体外诱导.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《不同成熟状态小鼠树突状细胞的体外诱导.pdf(4页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、书书书 第 15 卷第 3 期 2005 年 6 月 江 苏 大 学 学 报 (医 学 版) Journal of Jiangsu University (medicine) Vol. 15No. 3 Jun. 2005 不同成熟状态小鼠树突状细胞的体外诱导 马 斌,王胜军,邵启祥,马 洁,夏 圣,杨 敏,王锁英,许化溪 (江苏大学医学技术学院免疫学研究室, 江苏 镇江 212001) 摘 要 目的:体外诱导小鼠骨髓来源的不同成熟状态树突状细胞 (dendritic cells,DCs) 。方法:rmGM-CSF 体外 培养小鼠骨髓细胞, 5 6 d 后, 利用磁性细胞分离器 (MACS) 分
2、离 CD11c + 细胞, 部分细胞加入 rmTNF 继续培养 1 2 d, 通过流式细胞仪检测分别检测细胞表面标志, 同种混合淋巴细胞反应检测细胞的体外刺激能力。结果: 小鼠骨髓 细胞经 rmGM-CSF 培养 5 6 d, 再经过 MACS 分离可获得大量未成熟 DCs, 细胞表面出现少量短而粗的突起, 低水平 表达 MHC 分子和共刺激分子 CD80、 CD86 及 CD40, 刺激同种 CD4 + T 细胞的混合淋巴细胞反应能力较弱; 加入 rmTNF 继续培养可获得成熟 DCs, 细胞表面出现大量细长突起, 细胞表面高水平表达 MHC 分子和共刺激分子 CD80、 CD86 及 CD
3、40, 刺激同种 CD4 + T 细胞的混合淋巴细胞反应能力较强。结论:通过 rmGM-CSF 或 rmGM-CSF + rmTNF 体外培养体系可以获得大量未成熟 DCs 或成熟 DCs, 为进一步研究 DCs 的生物学功能提供实验基础。 关键词 树突状细胞;骨髓;培养;小鼠 中图分类号 R -33 文献标识码 A 文章编号 1671 -7783 (2005) 03 -0185 -04 Induction of Immature or Mature Fendritic Vells from Mouse Bone Marrow in Vitro MA Bing,WANG Sheng-jun,S
4、HA Qi-xiang,MA Jie,XIA Sheng,YANG min,WANG Suo-ying,XU Hua-xi (Department of Immunology,School of Medical Technology Jiangsu University,Zhenjiang Jiangsu 212001, China) Abstract Objective:To induce immature or mature murine dendritic cells in vitro. Methods:Bone marrow cells were cultured with rmGM-
5、CSF,and then CD11c + cells were purified by MACS. The matura- tion state of immature DCs(imDCs)or mature DCs(mDCs)was analysis by flow cytometry(FCM)analy- sis and mixed lymphocyte reaction(MLR) . Results:Bone marrow-derived imDCs or mDCs were success- fully induced with GM-CSF in vitro. The imDCs d
6、isplayed low levels of MHC class II,CD80,CD86,and CD40 moleculars,and were poor stimulators for autologous CD4 + T cells in MLR. Conversely,the mDCs showed high levels of MHC class II,CD80,CD86,and CD40 moleculars,and were strong stimulators for autologous CD4 + T cells in MLR. Conclusion:The large
7、numbers of imDCs or mDCs with high purity was obtained by rmGM-CSF or rmGM-CSF and rmTNF. It will be useful for future biological studies of DCs. Key words Dendritic cells;Bone marrow;Culture method;Mouse 树突状细胞 (dendritic cells,DCs) 是体内功能 最强的专职抗原递呈细胞 (antigen presenting cells, APCs) , 它是惟一既能启动初次免疫应答
8、又能有效 刺激再次应答的 APCs 1。然而, 许多实验证据表明 不同形式/ 成熟状态的 DC 在免疫应答或免疫调节 中发挥着重要作用。因此体外获得不同成熟状态的 DCs, 将有助于对 DCs 的生物学功能进行进一步研 究 2 4。本文通过 GM-CSF 体外诱导骨髓细胞分化 为未成熟 DCs (immature dendritic cells,imDCs) , 利 用磁性细胞分离器 (MACS) 分离纯化 CD11c + im- DCs, 加入 TNF- 刺激后, 可以获得成熟 DCs (mature dendritic cells,mDCs) , 为进一步研究不同成熟状态 DCs 的免疫功
9、能提供实验基础。 1 材料和方法 1. 1 实验动物 CBA 小鼠, BAL b/ c SPF 级, 雌性, 8 10 周龄, 购自中国科学院上海实验动物中心。 基金项目国家自然科学基金资助项目 (30300169) ;江苏省自然科学基金资助项目 (BK2004405) 作者简介马 斌 (1975 - ) , 男, 助理实验师;王胜军 (联系人) , 副教授, 硕士生导师, sjwjs ujs. edu. cn。 1. 2 主要试剂 小鼠 CD4 + T 细胞磁珠分离试剂盒、 磁珠标记抗 生物素试剂盒 (Miltenyi Biotec 公司产品) ; 抗小鼠 CD3 单抗, 生物素标记抗小鼠
10、CD11c 单抗, FITC-抗 小鼠 CD25 及 PE-抗小鼠 CD4、 抗小鼠 MHC 类分 子、 抗小鼠 CD80、 抗小鼠 CD86、 抗小鼠 CD40、 抗小 鼠 CD14 单 克 隆 抗 体 ( BD Phar mingen 公 司 产 品) ; 3H-TdR (中国同位素公司产品) ; Ficoll 分离液 (天津 TBD 公司产品) ; rmGM-CSF、rmTNF (Pepro- tech 公司产品) ; 丝裂霉素 C (Sigma 公司产品) ; RPMI1640、 胎牛血清 (Gibco 公司产品) 1. 3 小鼠未成熟 DCs (imDCs) 的诱导 断颈处死小鼠,
11、置 75%乙醇浸泡 5 min, 无菌取 出股骨, 置 75% 乙醇浸泡 3 5 min, PBS (pH 7. 4, 0. 1 mol/ L, 含 1% BSA, 下同) 冲洗。无菌操作下剪 开股骨两端, 0. 45 mm 直径注射针头插入骨髓腔, 10 ml PBS 冲洗骨髓, 轻轻反复吹打使之成为细胞悬 液, 4 1 000 r/ min 离心 5 min, 用 RPMI1640 再次 洗涤, 细胞计数。用含 10% 胎牛血清 (FBS) 的 RP- MI1640 完全培养基 (含 200 U/ ml rmGM-CSF) 将细 胞浓度调整为 2. 0 105/ ml, 置 37、 5%
12、CO2培养。 第 3 天, 加入新鲜的含 10% FBS 的 RPMI1640 完全 培养基 (含 200 U/ ml rmGM-CSF) 。第 5 天, 弃细胞 培养液, 加入新鲜的含 10% FBS 的 RPMI1640 完全 培养基 (含 200 U/ ml rmGM-CSF) , 置 37、 5% CO2 培养。第 6 天, 将上述培养体系中的悬浮细胞 4 1 000 r/ min离心 5 min, 弃细胞培养液, 加入 PBS 洗 涤, 收集细胞。 1. 4 CD11c + imDCs 分离纯化 取上述 1 107imDCs, 加入 10 g 生物素-抗小 鼠 CD11c 单抗, 混
13、合, 4 作用 20 min; 加入 5 ml PBS 洗涤, 4 1000 r/ min 离心 5 min, 弃上清, 重新 加入 100 l PBS; 加入 20 l 抗生物素标记的磁珠, 混合, 4 作用 15 min; 加入 10 ml PBS 洗涤, 4 1 000 r/ min离心 5 min, 弃上清, 重新加入 500 l PBS; 将 MS 分离柱置于 VarioMACS 磁场中的接合 器, 用 1 ml PBS 通过 MS 分离柱; 将 500 l 细胞悬 液加入 MS 分离柱, 然后每次加入3 ml PBS 洗涤, 共 4 次; 将 MS 分离柱与 VarioMACS 磁
14、场中的接合器 分离, 置于干净试管上, 加入 5 ml PBS, 用针栓快速 推下, 得到细胞悬液, 离心, 所获的细胞为 CD11c + imDCs。将收集的标记细胞 4 1 000 r/ min离心 5 min, 弃上清, 加入 1 ml PBS, 细胞计数, 台盼蓝排斥 试验证实活细胞率 95%。 1. 5 小鼠成熟 DCs (mDCs) 的诱导 将 2 106imDC, 加入 10 ml 新鲜的含 10% FBS 的 RPMI1640 完全培养基 (含 100 U/ ml rmGM-CSF 和 500 U/ ml rmTNF) , 置 37、 5%CO2继续培养 1 2 天; 弃细胞培
15、养液, 加入 PBS 洗涤, 收集的细胞 即为 mDCs。 1. 6 细胞形态学观察 取 1 105细胞涂片, 瑞特染色, 光学显微镜下 观察细胞形态。另取 1 106细胞, 加入戊二醛固 定, 透射电镜观察细胞形态。 1. 7 流式细胞仪分析细胞表面分子 将收集的细胞经 PBS 洗涤后, 调整细胞浓度为 2. 0 106/ ml, 取 0. 1 ml 细胞分别与 PE-标记单克隆 抗体4 作用30 min, 用 PBS 洗涤3 次, 然后将细胞 悬液通过流式细胞仪 ( BD 公 司 FACS Calibur, CELLQuest 分析软件) 进行细胞表型分析。 1. 8 同种混合淋巴细胞反应
16、 将 imDCs 或 mDCs 浓度调整为 1 106细胞/ ml, 加入 25 g/ ml 丝裂霉素 C, 37 孵育 45 min, Hanks 液洗 4 次, 用完全培养基悬浮, 分别以 2 104 细胞/ 孔、 1 104细胞/ 孔、 4 103细胞/ 孔、 2 103 细胞/ 孔加入 96 孔细胞培养板, 每组各 3 个复孔, 每 孔再加入同种 CD4 + T 细胞 2 105细胞/ 孔,37、 5% CO2培养72 h, 终止培养前8 h 加入1Ci 的3H- TdR, 通过细胞收集器将培养细胞收集于玻璃纤维 膜, 干燥, 将干燥的玻璃纤维膜置于闪烁瓶中, 加入 1 ml 闪 烁
17、液, 通 过 液 体 闪 烁 仪 ( Beckman 公 司 LS6500) 测定放射性 cpm 值。 2 结 果 2. 1 小鼠骨髓来源 DCs 的体外诱导培养 小鼠骨髓细胞经含有 rmGM-CSF 的 RPMI1640 培养液培养后, 可以形成大量骨髓来源的 DCs。在 培养过程中观察发现, 培养第 3 天, 培养皿中可见明 显细胞集落形成; 第 5 天形成较大细胞集落, 细胞数 目增加, 细胞边缘开始呈现少量不规则形态; 第 6 天, 细胞数目明显增加, 细胞表面出现少量短而粗的 突起。而经 TNF 刺激培养 1 2 天后, 细胞表面出 现大量细长的树枝状突起, 并且悬浮于培养液中。 培
18、养 6 天的细胞通过 MACS 进行分选, 获得 CD11c + 细胞作为 imDCs, 再经 TNF 刺激培养 1 2 天后的 DC 作为 mDCs, 通过光镜和投射电镜检查发 现 imDCs 细胞表面仅有少量粗短突起, 而 mDCs 细 胞表面存在大量细长突起, 结果见图 1。 681 江 苏 大 学 学 报 (医学版) 第 15 卷 左方分别为 imDC 的瑞氏染色和透射电镜图, 右方分别为 mDC 的瑞特染色和透射电镜图 (细胞表面突起明显增多) 图 1 imDC 和 mDC 形态学比较 2. 2 小鼠骨髓来源 DCs 的细胞表型分析 体外诱导的骨髓来源 DCs 在不同时期其细胞 表面
19、标记存在明显变化, 用不同荧光标记单克隆抗 体进行荧光染色, 通过流式细胞仪检测 imDCs 和 mDCs 细胞表型。结果发现 imDCs 低水平表达 MHC 分子和共刺激分子 CD80、 CD86 及 CD40, 不表达 单核细胞特征性表面分子 CD14; 经 TNF 刺激培养 后的 mDCs 细胞表面 MHC 分子和共刺激分子 CD80、 CD86 及 CD40 均有高水平表达, 同样不表达 单核细胞特征性表面分子 CD14。表明不同状态的 DC 细胞表面分子表达存在明显差异, 其中的一次检 测结果见图 2。 虚线空白图形为抗体同型阴性对照, 浅色图形为 imDC, 深色图形为 mDC。横
20、坐标表示荧光强度, 结果显示 mDCMHC类分子、 CD80、 CD86、 CD40 的表达明显高于 imDC 图 2 流式细胞仪分析 imDC 及 mDC 细胞表型 2. 3 DC 刺激的同种混合淋巴细胞反应 将 imDCs 和 mDCs 与同种 CD4 + T 细胞分别以 1: 10、 1: 20、 1: 50、 1: 100 的比例共同培养 72 h。结 果显示, mDCs 可明显刺激同种 CD4 + T 细胞的混合 淋巴细胞反应, 而 imDCs 虽然能刺激同种 CD4 + T 细胞的混合淋巴细胞反应, 但刺激强度明显低于 mDCs, 并且具有一定的剂量依赖关系, 结果见图 3。 3
21、讨 论 1973 年 Steinman 等从小鼠脾脏中首先分离出 具有树突样/ 伪足样突起的细胞, 并命名为树突状细 胞 (DCs) 。DCs 是机体内功能最强的专职 APC, 广 泛分布于除脑以外的全身各脏器, 外周组织的 DCs 在向中枢淋巴器官迁移的过程中不断成熟。根据 DCs 的成熟状态可分为未成熟 DCs (imDCs) 和成熟 DCs (mDCs) 。imDCs 的主要特征为细胞表面突起/ 伪足较短, 细胞表面低水平表达 MHC-类分子和 共刺激分子 CD80、 CD86 和 CD40, 以及细胞粘附分 子 ICAM-1、 ICAM-3, 具有较强的抗原捕获和处理能 力, 但刺激混
22、合淋巴细胞反应的能力较弱。mDsC 781第 3 期 马 斌等:不同成熟状态小鼠树突状细胞的体外诱导 主要特征为细胞形状不规则, 表面有大量细长突起/ 伪足; 细胞表面高表达 MHC-类分子和共刺激分 子 CD80、 CD86 和 CD40, 以及细胞粘附分子 ICAM- 1、 ICAM-3, 具有较强的抗原提呈能力; 在混合淋巴 细胞反应中具有较强的激活静止 T 细胞的能力; 同 时表达 CCR7, 具有向局部淋巴组织 T 细胞区迁移 的能力。近年来, 越来越多的证据表明 DCs 可以通 过调节 T 细胞免疫应答的类型, 在外周免疫耐受发 挥关键性作用 2 5。DCs 诱导刺激性 T 细胞或
23、调节 性 T 细胞的能力取决于 DCs 的成熟状态。 图 3 imDC 及 mDC 刺激的同种单向混合淋巴细胞反应 1992 年 Inaba 等 6首先用通过 GM-CSF 体外诱 导骨髓细胞产生大量 DCs, 其后 Lutz 等 7通过改进 的诱导方法可在体外利用一只小鼠的骨髓获得 1 108 3 108imDCs 或 mDCs。我们参照 Lutz 的方 法, 利用 10 cm 细胞培养皿在体外成功诱导出大量 细胞表面出现少量短粗状突起的 imDCs, 数目 108 以上。进 一 步 通 过 CD11c 阳 性 磁 性 分 选 获 得 CD11c + imDCs, 加入 rmTNF 继续培养
24、 1 2 天后, 可以见到大量具有细长树枝状突起的 mDCs。细胞 表型分析显示, imDCs 细胞表面低水平表达 MHC 类分子和共刺激分子 CD80、 CD86 和 CD40, 不表达 单核细胞特征性分子 CD14, 当加入 rmTNF 刺激 后, 细胞表面 MHC类分子和共刺激分子 CD80、 CD86 和 CD40 表达显著增强, 完全符合 mDCs 细胞 表型特征。同种混合淋巴细胞反应结果显示 mDCs 与 imDCs 相比, 具有刺激同种 CD4 + T 细胞的混合 淋巴细胞反应的能力明显增强。 上述结果表明通过体外 GM-CSF 培养体系可以 获得 大 量 imDCs, 经 TN
25、F- 刺 激 后, 可 以 获 得 mDCs, 将为进一步研究 DCs 的生物学功能提供细胞 学基础。 参考文献 1 Banchereau J,Steinman RM. Dendritic cells and the co- ntrol of immunity J . Nature, 1998, 392: 245 -52. 2 Jonuleit H,Schmitt E,Steinbrink K,et al. Dendritic cells as a tool to induce anergic and regulatory T cells J . Trends Immunol, 2001, 2
26、2: 394 -400. 3 Groux H,Fournier N,Cottrez F. Role of dendritic cells in the generation of regulatory T cells J . Se minars in Immunology, 2004, 16: 99 -106. 4 Kleindienst P,Wiethe C,Lutz MB,et al. Simultaneous induction of CD4 T cell tolerance and CD8 T cell immuni- ty by semimature dendritic cells
27、J . J Immunol,2005, 174: 3941 -3947. 5 马 洁, 王胜军, 胡嘉波, 等. 小鼠 CD4 + CD25 + 调节 T 细胞分离和鉴定 J . 江苏大学学报 (医学版) , 2005, 15 (2) : 117. 6 Inaba K,Inaba M,Romani N,et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cul- tures supplemented with granulocyte/ macrophage colony- stimulating factor J . J Exp Med,1992,176: 1693 - 1702. 7 Lutz MB,Kukutsch N,Ogilvie AL,et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow J . J Im- munol Methods, 1999, 223: 77 -92. 收稿日期 2005 -05 -24 881 江 苏 大 学 学 报 (医学版) 第 15 卷
链接地址:https://www.31doc.com/p-3697538.html