丙型肝炎病毒非结构蛋白5A与干扰素的应答耐受.pdf
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1、新医学2 0 0 6 年 1 月第3 7 卷第 1 期 丙型肝炎病毒非结构蛋白5 A与干扰素的应答耐受 暨南大学医学院微生物与免疫学教研室 ( 5 1 0 6 3 2 )王志鹏 述 综 革心革心举公苹必苹心 摘要丙型肝炎病毒是丙型病毒性肝炎的病原体,目 前缺乏有效的疫苗。干扰素是其主要治 疗药物, 但普遍存在耐受。丙型肝炎病毒非结构蛋白5 A在丙型肝炎病毒的干扰素耐受中发挥重要作用。 涉及的可能机制包 括:非结构蛋白5 A干扰素敏感决定区变异、抑制双链核糖核酸依赖性蛋白激酶、抑制 2 , 5 “ 寡腺普酸合成酶、诱生白介素一 8 和作用于干扰素的蛋白酪氨酸激酶和转录激动子信号途径。 关键词I丙
2、型肝炎 病毒非结构蛋白5 A干扰素耐受 举心苹公苹必举公苹贝 1 引言 丙型肝炎病毒 ( h e p a t i t i s C v i r u s , H C V )是一种严重威 胁人类生命健康的微生物,其感染面广、 危害性大。全球 有大约 1 . 7 亿丙型病毒性肝炎 ( 丙肝)患者, 仅我国就有 6 0 0 0 万感染者。H C V持续感染可导致慢性丙型病毒性肝炎 ( 慢丙肝) ,并可发展为肝硬化和肝细胞癌。目前缺乏有效 的H C V疫苗。治疗药物主要是干扰素,但 H C V对干扰素 具有耐受作用, 单独应用仅能使1 0 %一 1 5 %的病人获得持 续性病毒应答; 联合应用利巴韦林,
3、也只有3 0 %左右的病 人获得持续性病毒应答。因此研究H C V的干扰素耐受机制 并阻断其耐受作用,对于丙肝的有效治疗和流行的有效控 制有重要意义。非结构蛋白5 A是 H C V的诸多非结构蛋白 之一,在病毒感染过程中起重要作用。近年有诸多学者探 讨了非结构蛋白5 A与 H C V干扰素应答耐受之间的关系, 本文就其相关研究进展综述如下。 2 非结构蛋白5 A干扰素敏感决定区变异与 H C V干扰素应答耐受的关系 目 前根据H C V基因组序列的同源性,将 H C V分为6 个基因型和6 0 多个基因亚型。不同基因型及亚型 H C V对 干扰素治疗的敏感性不同, 如H C V - 1 感染者
4、对干扰素治疗 的应答率为3 8 % - 5 2 %, H C V - 2 , H C V 一感染者的应答率 则为9 0 %。有研究者还发现:在同一病人、同一时间检出 的不同H C V株之间对干扰素的敏感性也有差异。由此推测 H C V基因序列差异与干扰素耐受有关。 E N O M O T O等 ( 1 9 9 5 年)用分子生物学技术分析3 例 H C V 感染者体内病毒的高变区时,发现病人体内存在2 株 H C V 。一株在干扰素治疗后消失,为干扰素敏感株;另一 株治疗后仍存在, 为干扰素耐受株。分别对2 株H C V全基 因测序并对比基因序列及推导出来的氨基酸序列,发现该 3 例感染者的干
5、扰素抵抗株在非结构蛋白5 A区域分别存在 1 6 , 5 , 8 个氨基酸变异。其中第2 2 1 8 位氨基酸是整个基 因组序列中唯一同在3 例病人都出现变异的位点,该位点 可能在H C V干扰素耐受中发挥重要作用。E N O M O T O等进 一步对6 例干扰素耐受和9 例干扰素敏感的H C V - 1 b 感染 者进行病毒基因测序,并与H C V - 1 b 原始型 ( 包括H C V - J T a、H C V - j 4、H C V - j )基因进行序列对比。结果表明: 在干扰素敏感者的H C V非结构蛋白5 A区2 2 1 8 位周围4 0 个氨基酸序列 ( 2 2 0 9 一
6、2 2 4 8 )普遍存在错义突变,干扰 素耐受者的H C V该区域序列与H C V - 1 b 原始型高度一致。 遂将该段序列命名为干 扰素敏感决定区 ( i n t e r fe r o n s e n s i t i v - i t y d e t e r m i n i n g r e g io n , I S D R ) 。在另一实验中,E N O M O T O 等 ( 1 9 %年)从8 4 例H C V - 1 b 感染者血清中提取病毒核糖 核酸并对I S D R进行基因测序,然后用干扰素治疗。研究结 果显示:8 4 例病人中有 2 1 例对干扰素有应答,6 3 例无应 答。与
7、H C V - 1 b 原始型I S D R序列进行比较,干扰素应答组 病人的I S D R变异数目 高于不应答组病人5 : 1 , P 0 . 0 0 1 ) 0 其中有3 0 例病人H C V为野生型 ( 无变异) ,全对干扰素无 应答;1 6 例病人 H C V为突变型 ( 4个或以上的氨基酸变 异) , 全对干扰素应答; 3 8 例病人H C V为中间型 ( 1 一 3 个 氨基酸突变) ,有3 6例对干扰素无应答 ( P 0 . 0 0 1 ) 0 E N O M O T O等 ( 1 9 9 6 年)由此提出:非结构蛋白5 A I S D R 氨基酸序列变异数目 可作为 H C V
8、干扰素应答的独立预测因 素。 并且有学者认为其分子作用机制是: H C V的I S D R可 与宿主细胞内干扰素诱导的抗病毒基因产物双链核糖 核酸 ( d o u b l e s t r a n d r i b o n u c l u n c a c i d , d s R N A )依赖性蛋白 激酶作用, 削弱干扰素介导的抗病毒功能, 使得H C V在体 内 持 续存在川。 随后, 诸多学者继续进行了I S D R与H C V干扰素耐受 的相关性研究。有研究提示 I S D R与H C V干扰素耐受相关, 但也有I S D R 与H C V 干扰素疗效无关的研究报道 2 ,3 1 。 尤 其
9、对欧美国家人群的诸多研究表明了I S D R与H C V耐受干 扰素无关。同时,欧美人群少有多个突变的H C V - 1 b 分离 株; 感染H C V - 1 并有持续病毒应答的欧美人群的I S D R区 域只能检测到小数目 的病毒突变 4 。 对于上述结果迥异的 报道,由于多数的单个报道所涉及的研究对象数目太少, 很难对不同的研究结果作出判断。为进一步探讨 I S D R变 异与H C V 干扰素耐受的 关系, W I T H E R E L L 等 通过对已 报道的6 7 5 例非结构蛋白5 A I S D R序列建立数据库,对干 扰素敏感的I S D R序列变异进行独立性方差分析和L
10、o g i s t i c 回归分析, 发现干扰素应答与I S D R序列变异相关; 先前报 道的干扰素敏感性与 I S D R变异无关的研究, 结合在一起 进行统计, 也发现干扰素的疗效与I S D R序列变异有关。同 时,有研究者亦提出非结构蛋白5 A能以I S D R变异之外的 新医学2 0 0 6 年 1 月第3 7 卷第 1 期 机制发挥 H C V耐受干扰素治疗的作用、 一 。 总而言之,虽然目前对于 I S D R变异与 H C V干扰素耐 受之间的关系尚未取得广泛一致的意见,I S D R变异还是提 供了H C V耐受干扰素治疗的第一个分子机制的解释。 3 非结构蛋白5 A抑制
11、 d s R N A依赖性蛋白 激酶与H C V干扰素应答耐受的关系 d s R N A 依赖性蛋白激酶 ( d s R N A - d e p e n d e n t p r o t e i n k i - n a s e , P K R )是一种由干扰素诱生的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激 酶,在细胞中能被d s R N A激活。真核细胞起始因子2 ( e u - k a r v o t ic i n i t i a t i o n f a c t o r 2 , e I F 2 )是真核细胞蛋白质翻译中 的一个重要蛋白,能与谷氨酞转肤酶及蛋氨酸一 转移核糖核 酸结合;在其它起始因子的作用下,
12、结合到4 0 S 小亚基并 与m R N A连接, 最后形成翻译起始复合物启动蛋白质合 成。活化后的 P K R能磷酸化e I F 2 。亚单位第5 1 位的丝氨 酸, 磷酸化后的e I F 2 o t 亚单位转变为其自身的抑制物 e I F 2 仔 , 导致宿主细胞m R N A翻译起始受阻和病毒复制停 止,发挥抗病毒的作用。 M I C H A E L 等 ( 1 9 9 7 年)研究发现: 在体内和体外实 验中, 非结构蛋白5 A均可特异性地与P K R相互作用,相 互作用后不会导致 P K R降解或水解,但可抑制 P K R的生 物活性在酵母细胞和动物细胞中,非结构蛋白5 A均能 通过
13、对P K R的直接抑制作用, 恢复细胞蛋白质合成。缺乏 I S D R的非结构蛋白5 A则不能与P K R相互作用;推测是由 于I S D R的缺乏, 导致非结构蛋白5 A的蛋白质构型发生改 变, 进而阻断其与P K R结合:同时, 在酵母细胞中, 缺乏 I S D R的非结构蛋白5 A也不能作用于 P K R ,丧失抑制蛋白 质的合成能力。M I C H A E L等 ( 1 9 9 7年)由此提出:非结 构蛋白5 A可通过作用于P K R , 抑制干扰素的抗病毒作用。 牛痘病毒 ( v a c c i n i a v i r u s , V V )通过 E 3 L等蛋白的作 用, 可阻断干
14、扰素的信号通路。V V 8 E 3 L 是缺失E 3 L 基因 的牛痘病毒,因E 3 L 基因的缺失而丧失阻断干扰素信号通 路的能力二 V V 一 非结构蛋白5 A是将非结构蛋白5 A基因插 人V V 8 E 3 L中 E 3 L基因启动子后的重组牛痘病毒。H E 等!, 将V V , V V 6 E 3 L 和V V 一 非 结构 蛋白5 A 分 别 感染 海 拉 癌细胞株, 发现V V 8 E 3 L 感染细胞P K R和e I F 2 a 第5 1 位丝 氨酸的磷酸化水平明显高于 V V感染细胞和 V V 一 非结构蛋 白5 A感染细胞,研究结果表明非结构蛋白5 A可以抑制 P K R的
15、活性和e I F 2 a的磷酸化。前期研究已证实 e I F 2 a第 5 1 位丝氨酸的磷酸化程度改变1 5 %就能对蛋白质的合成产 生明显的影响H E等因而认为:非结构蛋白5 A可通过抑 制P K R对e I F 2 a 第5 1 位丝氨酸的磷酸化, 恢复宿主细胞蛋 白质合成和病毒复制。 p 3 8 一 丝裂原活化蛋白酶 ( m i t o g e n - a c t iv a t e d p r o t e i n k i - n a s e , M A P K )信号通路 中的 M A P K作用蛋 白激酶 1 ( M A P K - i n t e r a c t i n g p r
16、 o t e i n k i n a s e 1 , M n k l )可磷酸化 e I F 4 第2 0 9 位丝氨酸,磷酸化后的e I F 4与H C V宿主细胞位点的 结合能力提高, 可促进蛋白 质合成。M n k l 是闪8 的作用底 物, P K R则可影响户8 - M A P K 通路, 通过抑制P K R可导致 e I F 4 磷酸化受阻,降低 H C V宿主细胞位点依赖性的m R N A 翻译, 而病毒是非细胞性微生物, 其m R N A翻译影响核糖 体进人位点的依赖性, 不影响病毒蛋白质合成,有利于病 毒复制,非结构蛋白5 A作为一种 P K R的抑制物,具有维 持H C V
17、 感染早期m R N A翻译水平的功能。 H E 等还发现 v v 一 非结构蛋白5 A可阻断 E G F 诱导的 p 3 8 活化和e I F 4 磷酸化的作用。V v和 v v 一 非结构蛋白5 A 感染细胞蛋白 质表达量明显低于V V 8 E 3 L 感染细胞, V v和 v v 一 非结构蛋白5 A 感染细胞的病毒蛋白 表达量则明显高于 V V 8 E 3 L 感染细胞。由此, H E等提出: 非结构蛋白5 A ,可 通过抑制P K R来阻止e I F 4的磷酸化,进而减少宿主细胞的 m R N A翻译, 有利于病毒复制。 4 非结构蛋白5 A抑制2 , 5 一 寡腺普酸 合成酶与H
18、C V干扰素耐受的关系 P O D E V I N 等 I 以 疤疹 性口 炎 病毒和 脑心 肌炎 病毒为 攻 击病毒作用人肝细胞来源的细胞系H u h 7 时,非结构蛋白 5 A能削弱干扰素的抗病毒作用; 但非结构蛋白5 A并不影 响P K R的表达和生物活性,且共定位实验和免疫共沉淀实 验均未显示非结构蛋白5 A可与 P K R相互作用。说明非结 构蛋白5 A可通过P K R以外的物质,削弱干扰素抗病毒的 作用。 2 , 5 一 寡腺昔酸合成酶 ( o l i g o a d e n y l a t e s y n t h e ta s e , O A S )是一种干扰素诱导的抗病毒基因表
19、达产物,同P K R 一样, 在干扰素抗病毒中 发挥重要作用。 T A G U C H I 等 8 采 用共聚焦扫描技术, 发现非结构蛋白5 A和2 , 5 - O A S 共定位于细胞浆中的核周。免疫共沉淀显示非结构蛋白5 A 和2 , 5 - O A S 可形成复合体,相互结合部位为非结构蛋 白5 A氨基末端 1 / 3部分的 1 一1 4 8位氨基酸与2 , 5 - O A S 5 2 一 1 0 4 位或1 8 4 一 2 7 5 位氨基酸。当用脑心肌炎病毒 作为攻击病毒时, 非结构蛋白5 A ( 1 一 1 4 8 )可削弱干扰素 的 抗病毒作用。当非结构蛋白5 A ( 1 一 1
20、4 8 ) 3 7 位的苯丙 氨酸突变为天冬酞胺后, 非结构蛋白5 A ( 1 一 1 4 8 )与2 , 5 - O A S 结合能力降低,非结构蛋白5 A ( 1 一 1 4 8 )削弱干 扰素抗病毒作用的功能也明显下降。非结构蛋白5 A ( 1 1 4 8 ) I S D R及P K R结合序列缺失, 不能通过抑制P K R 来削 弱干扰素抗病毒的作用。因此, T A G U C H I 提出: 非结构蛋 白5 A能以与2 , 5 - O A S 相互作用的机制,削弱干扰素 抗病毒的作用。 5 非结构蛋白5 A诱生白介素一 8与 H B V干 扰素应答的关系 白介素一 8 是一含7 1
21、个氨基酸的C - x - c族趋化性细胞因 子, 最新研究证实白介素一 8能削弱干扰素抗病毒的作用。 同时在临床研究中,亦发现白介素一 8 与H C V的干扰素耐受 有关。 P O L Y A K 等 9 ; 比 较1 3 2 例H C V 感染病人和3 2 名正 常人血清中的白介素一 8 水平, 结果显示:H C V感染病人组 血清白 介素一 8 水平 ( 1 7 3 1 士 2 9 0 ) n g / L 明显高于正常组 ( 1 2 4 1 7 ) n g / L ( P 0 . 0 0 0 1 ) ,干扰素应答组病人血清 中白 介素一 8 水平明显低于干扰素耐受组 ( P 0 . 0 0
22、 1 ) 。研 究者认为:H C V可诱导白介素名的产生,并通过白介素一 8 新医学2 0 0 6 年 1 月第3 7卷第 1 期 削弱干扰素的抗病毒作用。K H A H A R等 ( 1 9 9 7 年)发现: 白介素一 8 在干扰素作用2 0 h 后才能发挥抑制干扰素抗病毒 的功能,因而推测白介素一 8 在转录后水平抑制干扰素的抗 病毒作用。 P O L Y A K 等 10 1 研究发现: 非结构蛋白5 A 表达可使白 介素一 8 m R N A 增加8 倍。同时, 用脑心肌炎病毒作攻击病 毒攻击白介素一处理的海拉癌细胞时, 病毒产量较不用白 介素一 8 处理的细胞高1 2 倍,白介素一
23、 8 可削弱干扰素诱导的 抗病毒作用 1 0 倍以上。将荧光报告基因置于白介素一 8 启动 子作用下, 非结构蛋白5 A能使荧光酶活力增加3 倍。实验 还证实非结构蛋白5 A通过激活白介素名基因启动子的方 式诱导白 介素一 8 的产生, 位于白 介素一 8 基因上游的1 3 3 个 碱基对 包括K 轻链核因子 ( n u c l e a r f a c t o r - K B , N F - K B ) , 氧化还原反应调控活化蛋白 一 1 和核因子一 白介素- 6 等的结合 位点是非结构蛋白5 A 激活白 介素一所必需。 N F - K B 、 氧 化还原反应调控活化蛋白一 1 结合位点突变
24、后,非结构蛋白 5 A激活白介素一 8 启动子的能力下降,核因子一 白介素- 6 结 合位点突变后, 非结构蛋白5 A激活白介素一 8 启动子能力 增强。氨基末端分别缺 1 1 0个或 2 2 2个氨基酸的非结构蛋 白5 A( 非结构蛋白5 A - N 1 1 0 / 非结构蛋白5 A - N 2 2 2 )仍具 备激活白介素- 8 的能力,竣基末端缺 1 1 7 个氨基酸的非结 构蛋白5 A( 非结构蛋白5 A - C 1 1 7 )失去激活白介素- 8 基因 的能力; 说明非结构蛋白5 A的梭基末端是激活白介素一 8 基因所必需。同时,非结构蛋白5 A - N 1 1 0和非结构蛋白 5
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- 肝炎 病毒 结构 蛋白 干扰素 应答 耐受
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