丁酸钠诱导RAJI细胞表达DAPK的研究.pdf
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1、丁酸钠诱导 Raji 细胞表达 DAPK 的研究 张海涛1, 2, 冯哲玲2, 梁念慈1, 朱振宇2, 马涧泉2 (1. 广东医学院生物化学与分子生物学教研室, 广东 湛江 524023; 2. 中山大学中山医学院生物化学与分子生物学教研室, 广东 广州 510089) 收稿日期: 2005 -07 -02, 修回日期: 2005 -09 -13 基金项目: 国家教委留学回国人员启动基金资助项目 2000 (No 479) 作者简介: 张海涛 (1970 - ) , 男, 博士, 副教授, 研究方向: 生化药理 学, 基因表达调控, Tel: 0759-2388581-5, E-mail: t
2、aohaizhang tom. com 朱振宇 (1966 - ) , 男, 博士, 教授, 博士生导师, 研究方向: 分子生物学, 通讯作者, Tel: 020-87330640, E-mail: zhuqun gzsums. edu. cn 中国图书分类号: R 329. 24; R 329. 28; R 394. 2; R 733. 402; R 977. 3 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2005) 12 -1438 -04 摘要: 目的 探讨丁酸钠 (SB) 对人淋巴瘤 Raji 细胞生长和 DAPK 表达变化的影响。方法 用丁酸钠作用于 Raji 细胞 株,
3、 观察形态、 增殖情况、 细胞周期分布变化、 死亡相关蛋白 激酶 (DAPK) 基因启动子甲基化的变化及该酶表达的变化。 结果 成团悬浮生长的 Raji 细胞呈现贴壁生长, 细胞增殖 速度明显被抑制, 细胞阻滞在 G0/ G1期; DAPK 启动子去甲 基化, DAPK 表达量增加, 细胞凋亡增加。结论 丁酸钠具 有诱导 Raji 细胞 DAPK 基因启动子去甲基化, 使 DAPK 重新 表达, 诱导细胞凋亡的作用。 关键词: Raji 细胞; 死亡相关蛋白激酶; 凋亡; 丁酸钠 研究表明, 由于 Raji 细胞的 DAPK 基因启动子 完全甲基化, 因而 Raji 细胞不表达 DAPK 1。
4、丁酸 钠及其衍生物是脱乙酰化酶 (HAD) 的抑制剂, 在体 外可以抑制多种肿瘤细胞增殖和诱导细胞分 化 2 4。组蛋白的乙酰化/ 去乙酰化基因启动子的 甲基化有关, 调控基因的表达 5。有文献显示丁酸 钠减低基因甲基化水平, 开启基因表达 6。本文研 究丁酸钠诱导 Raji 细胞的 DAPK 基因启动子去甲 基化及对 Raji 细胞生长的影响。 1 材料与方法 1.1 材料和试剂 Raji 细胞株 (中山大学肿瘤防治 中心提供) 以含体积分数为 0. 1 的小牛血清的 RP- MI1640 培养液于 5% CO2中培养。 逆转录酶, TRIzol 试剂 (Invitrogen 公司) ; L
5、A Taq 酶 (Takara 公司) ; RPMI1640 (Gibco 公司) ; 小牛 血清 (杭州四季青公司) ; 100 bp DNA Ladder和 100 bp DNA Ladder (Bebco 公司) ; 丁酸钠 (SB) , 碘化丙锭 (PI) , Hoechst33258(Sigma 公司) ; 氯仿 , 异丙醇 (国产分析纯) 。 1. 2 丁酸钠对 Raji 细胞的毒性 将生长状况良好 的 Raji 细胞 100 l 接种在 96 孔培养板中, 细胞浓 度为 1. 5 108L -1。加入不同浓度的丁酸钠, 37、 5% CO2连续培养 6 d 取样, 用 MTT 法
6、测细胞 活性。记录各组细胞的吸光度值 (A 值) 。 1. 3 丁酸钠对细胞形态的影响 将生长状况良好 的 Raji 细胞 100 l 接种在 96 孔培养板中, 细胞浓 度为 1. 0 109L -1。加入不同浓度的丁酸钠, 37。5% CO2连续培养3 d 光镜观察, 另取样进行 透射电镜 (中山医学院电镜室处理样品) 观察。 1. 4 细胞周期分析 细胞浓度为 1. 5 109L -1 用 0、 3、 6 mmolL -1丁酸钠处理 Raji 细胞24、 48、 72 h, 收集细胞, 用磷酸缓冲液洗细胞, 体积分数为 0. 75 的预冷乙醇固定过夜,500 g 离心 10 min, 弃
7、 乙醇,用含 PI 100 mg L -1 0. 5% Triton-x100。 RNase 200 mgL -1孵育 15 min, 流式细胞仪检测。 1. 5 丁酸钠诱导 Raji 细胞 DAPK 基因启动子去甲 基化 DNA 抽提。参照文献进行甲基化特异性 PCR (MSP) 7。PCR 引物: 设计 DAPK 基因甲基化 引物 (DAPK-M) 及 DAPK 非甲基化引物 (DAPK - U) , 引物由上海生物工程公司合成, 序列如下: DAPK-M: 上游引物: 5-GGATAGTCG- GATCGAGTTAACGTC-3。下 游 引 物:5-CCCTC- CCAAACGCCGA3
8、。DAPK-U: 上游引物: 5-GGAG- GATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3。下游引物: 5- CAAATCCCTCCCAAACACCAA-3。PCR 反应体系: MgCl22. 5 mmolL -1, dNTP 1. 6 mmolL-1, 引物 0. 4 molL -1。PCR 反应条件: 95 预变性 5 min, 冰浴冷却后, 加入 Taq 聚合酶 2. 0 U。DAPK- M, DAPK-U 扩增条件: 95 45 s, 62 45 s, 72 45 s, 35 个循环, 最后 1 个循环 72 延伸 7 min。取扩 增产物至 2. 5%琼脂糖凝胶中电泳, 凝胶图
9、像成像。 1. 6 丁酸钠诱导 Raji 细胞 DAPK 基因表达 总 RNA 的提取按照 Invitrogen 公司提供的 TRIzol 试剂 说明书进行操作。500 g 离心 5 min, 收集细胞, 1 8341中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec; 21 (12) : 1438 41 ml TRIzol 试剂裂解细胞, 待细胞完全裂解后, 加入 0. 2 ml 氯仿, 上下颠倒混匀 5 6 次, 静置 5 min。 4, 10 000 g 离心 15 min。收集上层液体。加入 0. 5 ml 异丙醇, 混匀, 4, 10
10、000 g 离心10 min, 弃 上清液, 用无水乙醇漂洗沉淀, 加 30 l DEPC 处理 水溶解, 260 nm 和 280 nm 测光吸收值, 评估 RNA 量及纯度。 逆转录按照 Invitrogen 公司的说明书进行逆转 录, 总 RNA 约 2 g, dNTP 0. 5 mmolL -1, OligdT 15 0. 1 molL -1, 65, 5 min, 加 M-MLV 200 U 和酶 反应缓冲液, 37延伸时间 75 min。检测引物参照 文献 8: DAPK: 上游引物: 5-GATAGAAATGTCCCCAA- A-3; 下游引物: 5-TCTTCTTTGGATCC
11、TTGA-3。- actin: 上游引物: 5-GCGGGAAATCGTGCGTGA-3; 下 游引物: 5-GATGGAGTTGAAGGTAGTTT-3。 PCR 条件: MgCl22. 5 mmol L -1, dNTP 1. 6 mmolL -1, 引物 0. 4 molL-1, LA Taq 酶 2. 5 U; 模板1 l, 94, 3 min; 94, 30 s, 58, 30 s, 72, 5 min, 30 个循环; 72, 6 min。反应完成后, 取 10 l 样品在 2%的琼脂糖凝胶电泳, 在紫外灯下观察, 成 像。 2 结果 2. 1 丁酸钠对 Raji 细胞生长的影响
12、结果如 Fig 1 所示。丁酸钠浓度为 0. 75 6 mmolL -1对 Raji 细 胞体外生长均有抑制作用, 并呈明显的剂量依赖关 系。在同一药物浓度下, 细胞生长抑制程度随作用 时间延长而逐渐增加。对照组的生长速度比实验组 要快, 很快进入平台期。对照组从 d 5 起细胞生长 下降, 可能是培养基消耗造成。而各实验组则因为 Fig 1 Effect of SB on growth of Raji cells Raji cells treated with different concentrations of sodium butyrate vs control cells(multi
13、ple comparison) , *P 0. 05,*P 0. 01 增殖慢, 培养基消耗减缓, 仍然继续生长。 2. 2 丁酸钠诱导细胞贴壁生长 如 Fig 2 所示。经 不同浓度的丁酸钠处理后, Raji 细胞由成团悬浮生 长变成贴壁生长, 细胞由圆形转变为成纤维状或星 形, 生出的纤维状轴丝比胞体长, 并有再次分支现 象, 胞体和纤维分支中有液体状小泡, 电镜下可见有 明显的空泡。电镜下呈典型的细胞凋亡状。 Fig 2 Observation of effect of sodium butyrate on morphology of Raji cells A:Control cells
14、( 400) ;B:Cells were treated with 3 mmol L -1 sodium butyrate( 400) ;C:Control cells. Observed by electronic microscope;D:Cells were treated with 3 mmolL -1 sodium butyrate. Observed by electronic microscope,arrow indicated apoptosis of cells 2. 3 丁酸钠阻断 Raji 细胞在 G0/ G1期 结果见 Tab 1。正常培养和丁酸钠处理的 Raji 细胞
15、也随培 养时间的延长 (24 72 h) G0/ G1期细胞出现增加的 趋势, S、 G2期细胞减少趋势, 正常培养的 Raji 细胞 出现这种现象可能与细胞增殖迅速, 消耗营养造成。 同一时间点的各组细胞比较, 可发现丁酸钠处理组 在 24 h 时, G0/ G1和 G2细胞比率增加趋势, S 期细 胞减少趋势。丁酸钠处理组在 48 72 h 时 G0/ G1 增加趋势, S、 G2期细胞减少趋势。推断 S 期的 Raji 细胞可能对丁酸钠最敏感, 随时间延长 G2期细胞也 受丁酸钠的影响, 最终细胞都阻止在 G0/ G1。 Tab 1 Effect of SB on Raji cells
16、cycle (%) SB / mmolL -1 24 h G0/ G1SG2 48 h G0/ G1SG2 72 h G0/ G1SG2 044.643.7 11.757.117.5 25.476.810.6 13.5 364.611.0 24.591.64.83.688.48.1 3.5 656.010.8 33.282.312.1 5.687.33.8 8.9 2. 4 丁酸钠诱导 Raji 细胞 DAPK 基因表达 从 Fig 3 结果可知, 丁酸钠可以诱导 Raji 细胞 DAPK 基 9341中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005
17、Dec; 21 (12) 因启动子去甲基化。Fig 4 结果显示, 丁酸钠诱导 Raji 细胞 DAPK 基因表达增高趋势。可见丁酸钠诱 导 Raji 细胞 DAPK 基因启动子去甲基化后可恢复 DAPK 表达。 Fig 3 Analysis of the methylation of DAPK gene promoter in Raji cells induced by sodium butyrate for different days Line 1 6 were amplified with methylation primers. 1: 0 days; 2: 2 days; 3: 4
18、days; 4: 6 days; 5: 8 days; 6: 10 days; 7: DAN marker (100 bp DNA Ladder) ; line 8 13 were amplified with demethylation primers. 8: 0 days; 9: 2 days; 10: 4 days; 11: 6 days; 12: 8 days; 13: 10 days. Fig 4 Analysis of DAPK expression in Raji cells Analysis of DAPK mRNA in Raji cells with RT-PCR. 1:
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