中国牦牛β珠蛋白基因的克隆和序列分析.pdf
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1、第3 4卷第1期西北农林科技大学学报(自然科学版) Vo l . 3 4 No . 1 2 0 0 6年1月J o u r .o f No r t h we s t S c i - T e c hUn i v .o f Ag r i .a n dF o r . ( Na t .S c i .E d . )J a n .2 0 0 6 中国牦牛 - 珠蛋白基因的克隆和序列分析 * 袁青妍1,张庆波1,黄治国1,谢庄1,殷甫路2,赵永华3 ( 1南京农业大学 动物科技学院,江苏 南京2 1 0 0 9 5 ; 2红松洼种畜场,河北 承德3 1 0 0 3 4 ; 3龙日种畜场,四川 红原6 2 4
2、 4 0 0 ) 摘 要根据黄牛 - 珠蛋白基因的序列设计引物,扩增了中国牦牛的 - 珠蛋白基因,并对其进行了克隆测序 和氨基酸序列比较分析。结果显示,其与黄牛 - 珠蛋白基因的同源性很高,达到9 7 %以上;检测到中国牦牛 - 珠蛋白 基因的2个等位基因 7 3 As n和1 3 5 As n, 其中6 7号牦牛个体中检测到2个等位基因 7 3 As n和1 3 5 As n, 6 4号牦牛个体中检测到 等位基因 1 3 5 As n, 1 0 7 8号牦牛个体中检测到等位基因 7 3 As n; 等位基因 1 3 5 As n是中国牦牛特有的一个等位基因, 推测该 等位基因编码的第1 3
3、5位氨基酸天冬酰胺,可能会降低牦牛血红蛋白的氧亲和力。 关键词 牦牛; -珠蛋白基因;等位基因;氧亲和力 中图分类号 Q7 8 5文献标识码 A文章编号 1 6 7 1 - 9 3 8 7 ( 2 0 0 6 ) 0 1 - 0 1 0 0 - 0 5 牦牛主要分布在海拔30 0 0m以上的寒冷、低 氧地区,那里的空气氧含量只有海平面的1 / 3 1 / 2 。 牦牛的一个显著特征就是对高原低氧环境具有极好 的适应性,其血液中红细胞和血红蛋白的含量分别 为6 . 6 1 8 . 0 5万/ mm3和9 9 . 2 1 1 3 . 8g / L ,均远高 于黄牛的4 . 5 0万/ mm3和8
4、1 . 2g / L 1 , 并且其血红 蛋白的氧亲和力也比黄牛的高 2 。L a l t h a n t l u a n g a 等 3 - 4 分别于1 9 8 1和1 9 8 5年测定了牦牛血红蛋白2 条链及2条链的氨基酸序列,并推测牦牛血红蛋 白氧亲和力高的原因可能是由于 1 3 5位的缬氨酸 代替了丙氨酸所致。1 9 8 8年We b e r等 5 进一步分析 认为,由于缬氨酸疏水性更强,且体积比丙氨酸大, 会对H-螺旋产生影响,从而引起牦牛血红蛋白氧 亲和力增高。但对牦牛 -珠蛋白基因的核苷酸序列 至今尚未见报道。为此,本试验克隆并分析了牦牛 - 珠蛋白基因,以期能揭示牦牛血红蛋白
5、氧亲和力 高的分子基础。 1 材料与方法 1 . 1 材料 1 . 1 . 1 牦牛D NA样品牦牛血样分别采自河北省 红松洼种畜场( 6 4和6 7号牦牛个体)和四川省龙日 种畜场( 1 0 7 8号牦牛个体) ,按参考文献 6 的方法 提取基因组D NA。 1 . 1 . 2 引物参照黄牛 -珠蛋白基因序列,设计 了4对引物,引物序列见表1 ,由上海博亚公司合成。 其中,第1 3对引物用于扩增6 7号牦牛个体的 -珠 蛋白基因,第4对引物用于扩增6 4和1 0 7 8号牦牛个 体的 -珠蛋白基因。 表1扩增所用的引物 T a b l e1 P r i me r sf o ra mp l i
6、 f i c a t i o n 引物P r i me r s引物序列P r i me r s e q u e n c e 第1对引物T h ef i r s t p r i me r上游Up s t r e a m: 5 - C AGAAAG AGG G CT G AT G GT C TAAAG- 3 下游D o wn s t r e a m: 5 - G G AG AAC ACT G AG G AT T CC ACAAAC - 3 第2对引物T h es e c o n dp r i me r上游Up s t r e a m: 5 - AC TT G TC C AC T GC T GAT
7、GC T GT T AT - 3 下游D o wn s t r e a m: 5 - C C AAG GT T AG ATT C AG G GT ATT T CA- 3 第3对引物T h et h i r dp r i me r上游Up s t r e a m: 5 - C T TAT AT C TAC GG T CAC AG C TT G GG- 3 下游D o wn s t r e a m: 5 - T ATT T TC T CAAGG T CT C GAC TAG CC - 3 第4对引物T h ef o u r t hp r i me r上游Up s t r e a m: 5 - C
8、AGAAAG AGG G CT G AT G GT C TAAAG- 3 下游D o wn s t r e a m: 5 - C T GC AAC T TG AAT T CT T TAAGG G AG - 3 收稿日期 2 0 0 5 - 0 5 - 3 0 作者简介 袁青妍( 1 9 7 1 -) ,女,陕西韩城人,在读博士,主要从事动物分子数量遗传学研究。 通讯作者 谢庄( 1 9 4 7 -) ,男,江苏无锡人,教授,主要从事动物分子数量遗传学研究。E - ma i l : z x i e n j a u . e d u . c n 1 . 1 . 3 主要试剂 P e r o b e
9、s t酶购自T a Ka R a公司; p G E M- T e a s y载体购自P r o me g a公司; 其余试剂均 为国产分析纯。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 P C R扩增 扩增6 7号牦牛 -珠蛋白全基因 所 用的反应体系( 1 0 L )为: 5 0n g / LD NA 0 . 8 L , 1 0 mo l / L上游引物0 . 2 L , 1 0 mo l / L下游引 物0 . 2 L , 1 0mmo l / Ld NT P混合物0 . 8 L , 1 0 缓 冲液1 L , P r o b e s t酶0 . 0 5 L , d d H2O6 . 9 5
10、L 。反 应程序: 9 4预变性5mi n ; 9 4变性1mi n ,退火1 mi n ( 退火温度:引物1为6 4 . 5;引物2为6 0 . 5; 引物3为5 6 . 5) , 7 2延伸1mi n , 3 5个循环;最后 7 2延伸1 0mi n 。 扩增6 4和1 0 7 8号牦牛 -珠蛋白全基因的反应 体系为: 5 0n g / LD NA 0 . 8 L , 1 0 mo l / L上游引 物0 . 2 L , 1 0 mo l / L下游引物0 . 2 L , 1 0mmo l / L d NT P混合物0 . 8 L , 1 0 缓冲液1 L , P r o b e s t酶
11、 0 . 0 5 L , d d H2O6 . 9 5 L 。反应程序: 9 4预变性5 mi n ; 9 4变性1mi n , 6 0 . 7退火1mi n , 7 2延伸 1 4 0s , 3 5个循环;最后7 2延伸1 0mi n 。 1 . 2 . 2 扩增产物的克隆与测序扩增产物经1 5 g / L琼脂糖凝胶电泳后, 利用D NA凝胶回收试剂盒 回收纯化扩增产物。将纯化后的6 7和6 4号牦牛个体 - 珠蛋白基因的扩增产物,在T 4D NA连接酶的作用 下与p G E M- T e a s y载体连接, 4过夜。将5 L连接 产物加入2 0 0 LJ M1 0 9感受态菌液中,冰浴3
12、 0 mi n , 4 2水浴9 0s ,加入8 0 0 L培养基,于3 7下 1 2 3 / mi n培养4 5mi n后, 再60 0 0 / mi n离心1 0mi n , 弃去8 0 0 L上清液,将剩余物用移液器轻轻混匀后 涂布于含有I P T G、 X - g a l和Amp( 1 0 0 g / mL )的培 养基上, 3 7培养过夜。挑取白色克隆接种于3mL L B液体培养基中, 3 7摇菌过夜。对鉴定为阳性的 克隆进行测序。1 0 7 8号牦牛个体 -珠蛋白基因的扩 增产物则直接进行测序。测序由上海英骏生物技术 有限公司完成。 1 . 2 . 3 扩增产物的序列分析将所测牦牛
13、 -珠蛋 白基因序列用D NAS t a r软件进行同源比较。 2 结果与分析 2 . 1 6 7号牦牛个体 - 珠蛋白全基因扩增结果 以6 7号牦牛个体的D NA为模板,采用3对引物 分别扩增牦牛 -珠蛋白全基因,第1对引物扩增到1 条约6 9 7b p的片段,第2对引物扩增到1条约7 1 6b p 的片段,而第3对引物扩增到1条约7 7 4b p的片段, 见图1 。 2 . 2 6 4和1 0 7 8号牦牛个体 - 珠蛋白全基因扩增结 果 分别以6 4号和1 0 7 8号牦牛个体的D NA为模 板,采用1对引物扩增牦牛 -珠蛋白全基因,结果均 扩增到1条约20 3 4b p的片段,见图2
14、。 图1 6 7号牦牛个体 - 珠蛋白 全基因的P C R扩增结果 M. p B R 3 2 2D NA/ Al u ma r k e r ; 1 .第1对引物扩增产物; 2 .第2对引物扩增产物; 3 .第3对引物扩增产物 F i g . 1 R e s u l t sf o ra mp l i f y i n gy a k - g l o b i ng e n e o f i n d i v i d u a l 6 7u s i n gt h r e ep r i me r s M. p B R 3 2 2D NA/ Al u ma r k e r ; 1 . r e s u l t f
15、o r p r i me r1 ; 2 . r e s u l t f o r p r i me r2 ; 3 . r e s u l t f o r p r i me r3 图2 6 4和1 0 7 8号牦牛个体 - 珠蛋白 全基因的P C R扩增结果 M. 1 0 0b pD NAl a d d e r ; 1 . 6 4号牦牛个体的扩增产物; 2 . 1 0 7 8号牦牛个体的扩增产物 F i g . 2 R e s u l t sf o ra mp l i f y i n gy a k - g l o b i n g e n eo f i n d i v i d u a l 6 4a
16、n d1 0 7 8u s i n go n ep r i me r 1 . t h eP C Rr e s u l t f o r i n d i v i d u a l 6 4 ; 2 . t h eP C Rr e s u l t f o r i n d i v i d u a l 1 0 7 8 ; M. 1 0 0 b pD NAl a d d e r 2 . 3 序列差异比较 将6 4 , 6 7和1 0 7 8号牦牛个体 -珠蛋白基因所编 码的氨基酸序列,与已发表的牦牛及黄牛 -珠蛋白 链的氨基酸序列进行同源性比较分析。结果发现,其 只在第5 0 , 7 3 , 1 1 7和1
17、3 5位有差异,具体差异情况详 见表2 。 101 第1期袁青妍等:中国牦牛 - 珠蛋白基因的克隆和序列分析 表2 6 4 , 6 7和1 0 7 8号牦牛与已发表的牦牛和黄牛 - 珠蛋白氨基酸序列比较结果 T a b l e2 C o mp a r i s o no f t h ed e d u c e da mi n oa c i do f s e q u e n c i n gy a k - g l o b i ng e n e wi t hk n o wny a ka n dc a t t l e - g l o b i nc h a i n s 比较项目 I t e m f o r
18、c o mp a r i s o n 5 0位 P o s i t i o n5 0 7 3位 P o s i t i o n7 3 1 1 7位 P o s i t i o n1 1 7 1 3 5位 P o s i t i o n1 3 5 黄牛 A链 C a t t l e Ac h a i n 苏氨酸( AC T ) T h r( AC T ) 天冬酰胺( AAT ) As n( AAT ) 天冬酰胺( AAT ) As n( AAT ) 丙氨酸( G C T ) Al a( G C T ) 牦牛 链Ya kc h a i n 苏氨酸T h r谷氨酸G l u天冬酰胺As n丙氨酸Al
19、 a 牦牛 链Ya kc h a i n 丝氨酸S e r天冬酰胺As n组氨酸Hi s缬氨酸Va l 6 4号牦牛个体的测序结果 T h er e s u l t f o r i n d i v i d u a l 6 4 丝氨酸( T C T ) S e r( T C T ) 天冬酰胺( AAT ) As n( AAT ) 组氨酸( C AT ) Hi s( C AT ) 天冬酰胺( AAT ) As n( AAT ) 6 7号牦牛个体的测序结果 T h er e s u l t f o r i n d i v i d u a l 6 7 苏氨酸( AC T ) T h r( AC T )
20、 天冬酰胺( AAT ) As n( AAT ) 组氨酸( C AT ) Hi s( C AT ) 天冬酰胺( AAT ) As n( AAT ) 1 0 7 8号牦牛个体的测序结果 T h er e s u l t f o r i n d i v i d u a l 1 0 7 8 苏氨酸( AC T ) T h r( AC T ) 天冬酰胺( AAT ) As n( AAT ) 天冬酰胺( AAT ) As n( AAT ) 丙氨酸( G C T ) Al a( G C T ) 注:括号内为氨基酸所对应的密码子。 No t e s : T h ec o d ef o r r e s i d
21、 u ei si np a r e n t h e s i s . 由表2可以看出, 1 0 7 8号牦牛个体的 -珠蛋白 基因与黄牛的同源性高达9 9 . 7 3 %,其所编码的氨基 酸序列与黄牛的 A链完全一样, 与已发表的牦牛 链只在第7 3位不同,与牦牛 链在5 0 , 1 1 7和1 3 5位 不同(见表2 ) 。由此可认为,本试验所扩增的1 0 7 8号 牦牛个体 -珠蛋白基因中存在牦牛 链的一个新等 位基因,记为 7 3 As n。 6 4号牦牛个体的 - 珠蛋白基因与黄牛的同源 性高达9 7 . 8 5 %。其所编码的氨基酸序列与黄牛的 A 链相比,有3个氨基酸不同,即第5 0
22、 , 1 1 7和1 3 5位不 同;与已发表的牦牛 链有4处不同, 即5 0 , 7 3 , 1 1 7 和1 3 5位不同;与牦牛 链只有一处不同, 即第1 3 5 位不同(见表2 ) 。由此可认为,本试验所扩增的6 4号 牦牛个体 -珠蛋白基因中存在牦牛 链的一个新等 位基因,记为 1 3 5 As n。 6 7号牦牛个体的 - 珠蛋白基因以第1对引物进 行扩增,产物长度为6 9 7b p 。与黄牛的 A链基因相比 仅有一处不同,即第2内含子的第2 0个碱基不同;以 第2和第3对引物进行扩增,产物与黄牛的 A链基 因相比有3 4处不同,这3 4处中有3 0处与6 4号牦牛 个体 -珠蛋白
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- 中国 牦牛 珠蛋白 基因 克隆 序列 分析
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