不同压力刺激对大鼠牙槽骨成骨细胞环氧合酶2表达的影响.pdf
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1、临床口腔医学杂志2 0 0 8 年6 月第2 4 卷第6 期JC l i nS t o m a t o l J u n ,2 0 0 8 ,V 0 1 2 4 N o 6 不同压力刺激对大鼠牙槽骨成骨细胞 环氧合酶一2 表达的影响术 段小红1 抻,毛勇1 ,汪卫国2 张少锋1 ( 1 第四军医大学口腔医学院陕西西安7 1 0 0 3 2 ;2 解放军第1 6 3 医院口腔科) 摘要目的:研究S D 大鼠牙槽骨成骨细胞在不同压力刺激下环氧合酶一2 ( c o x 一2 ) 蛋白的表达特点。方法:采 用自行研制的可调压式细胞培育箱对原代培养的牙槽骨成骨细胞加载持续性静压力和间歇性静压力,用免疫细胞
2、化 学染色和W e s t e r nb l o t 检测C O X 一2 蛋白的表达。结果:C O X 一2 蛋白的表达强度随着压力刺激作用时间的延长逐渐增 强,但两种不同压力刺激对其表达量无显著性差异。结论:一定范围内不问形式的压力刺激均可诱导丈鼠牙槽骨成骨 细胞C O X 一2 蛋白表达,并继而影响牙槽骨成骨细胞的增殖、分化、成熟,继而影响牙槽骨的吸收及新生和重建。 关键词 成骨细胞;环氧合酶一2 :持续性静压力:间歇性静压力 中图分类号 Q 7 8 6 文献标识码 AE 3 c 章编号 1 0 0 3 1 6 3 4 ( 2 0 0 8 ) 0 6 - 0 3 4 1 - - 0 4
3、3 4 1 E f f e c t so fi n d u c i b l ee x p r e s s i o n so fc y c l o o x y g e n a s e - 2o nc u l t u r e dr a ta l v e o l a ro s t e o b l a s t sb yd i f f e r e n tc o m p r e s - s i v ep r e s s u r e sl o a d i n g D U A NX i o o 一幻,皤,M A 0Y o n g ,W A N GW e i - g u o ,Z H A N GS h a o
4、- f e n g S c h o o lS t o m a t o l o g y ,t h e F o u r t hM i l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s 咖,X i “ a n7 1 0 0 3 2 ,C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e :T od e t e r m i n et h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc o m p r e s s i v ep r e s s u r e so ni n d u c i b l ec y c l o o
5、x y g e n a s e 2e x - p r e s s i o n so fc u l t u r e dr a ta l v e o l a ro s t e o b l a s t s M e t h o d :As e l f m a d ec o m p r e s s i v ed e v i c ew a su s e dt oa p p l yc o n t i n u o u s l yo r i n t e r m i t t e n t l yc o m p r e s s i v ep r e s s u r e so nt h em o n o l a y e
6、 rc e l l s I m m u n o c y t o c h e m i c a ls t a i n i n ga n di m m u n o b l o t sw e r ep e r f o r m e d w i t hp o l y c l o n a lr a b b i ta n t i c y c l o o x y g e n a s e 一2 R e s u l t :T h ee x p r e s s i o n so fe y c l o o x y g e n a s e - 2W a si n c r e a s e di nt h em a n n
7、e ro f m e c h a n i c a ll o a d i n gt i m e ,b u ts h o w e dn os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c eb e t w e e nc o n t i n u o u s l ya n di n t e r m i t t e n t l yc o m p r e s s i v ep r e s s u r e g r o u p C o n c l u s i o n :Ac e r t a i nr a n g eo fd i f f e r e n tm e c h a n i
8、c a ls t i m u l a t i o n sc a ni n d u c et h ee x p r e s s i o n so fe y c l o o x y g e n a s e - 2i n c u l t u r e da l v e o l a ro s t e o b l a s t sa n da f f e c tt h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r so fa l v e o l a ro s t e o b l a s t ss u c ha sp r o l i f e r a t i o n s ,d i
9、f f e r e n t i a t i o n s a n dm a t u r i t i e sa n dt h e nl e a dt oa l v e o l a ra b s o r p t i o n s ,r e p r o d u c t i o n sa n dr e b u i l d i n g s K e yw o r d s o s t e o b l a s t s ;e y c l o o x y g e n a s e - 2 ;c o n t i n u o u s l yc o m p r e s s i v ef o r c e ( C C F ) ;
10、i n t e r m i t t e n t l yc o m p r e s s i v ef o r c e ( I C D 基金项目:国家自然科学基金资助( 3 0 1 0 0 2 1 1 ) 通讯作者:段小红:E m a i l :x h d u a n f m m u e d u c n 臭氧老化百分变化率是表示硅橡胶耐老化性能的 o f a c i a lm a t e r i a l sa saf u n c t i o no fa c c e l e r a t e da g i n g 啪JP r o s t h e t 重要指标,其绝对值的大小能够较好地反映硅橡胶的D e
11、 n t , 1 9 9 4 ,7 1 ( :3 7 9 - 3 8 3 里孝华性能,绝对值越大,说明老化后性能改变越大,闭黧耋霍裟震裹黧和新月5 2 9 - 1 9 形试样9 9 , 硫化,橡 耐老化能力越差。表2 显示,S Y 一2 8 硅橡胶的永久变形 圈H a u gs P ,M 0 0 心B K ,A 。d r e 。c J c o l 。m b i l i t ya n d 。o l 。t 舭t 率和邵氏硬度优于M D X 一4 _ 4 2 1 0 硅橡胶;扯断强度、扯m a x i l l o f a c i a le l a s t o m e r s P a r tl h w
12、 e a t h e r i n ge f f e c t p h y s i c a lp m p e 一 断伸长率和撕裂强度与M D X 一4 4 2 1 0 硅橡胶相似。可t r i e s J JP r o s t h e tD e n t ,1 9 9 9 ,8 1 ( 4 ) :4 2 3 - 4 3 0 以认为S Y 一2 8 硅橡胶机械性能优良,具有良好的耐臭 氧老化性能,可以满足作为颜面部软组织缺损赝复材 料的要求。 E 1 3 D 参考文献 A n & a sC J ,H a n gS P , B r o w nl y r ,e ta 1 E f f e c t s o f
13、e n v i r o n m e n t a lf j c t o 瑁O nm a x i l l o f a c i a le l a s t o m e r s :P a r t1 I R e p o r to fs u r v e y 田JP r o s t h e tD e n t ,1 9 9 2 ,6 8 :5 1 9 5 2 2 P o l y z o i sG L Ac o m p a r i s o no fm i c r o w a v ea n dd r y h e a tc u r i n g m e t h o d so nt h eb o n ds t r e n
14、 g t ho fs i l i c o n ef a c i a lm a t e r i a l sa p p l i e dt O a c r y l i c ,r e s i n J JP r o s t h o d o n t ,1 9 9 6 ,5 ( 2 ) :1 0 1 - 1 0 4 、 D o o t zE R ,K o r a nA ,C r a i gR G P h y s i c a lp m p o r t i e so ft h r e em a x i l l E 6 3 H u h e r s t m mA K ,R u y t e rI E C h a n
15、g e si na p p e a r a n c eo fs i h c o n e e l a s t o m c r sf o rm a x i l l o f a c i a lp m s t h e , s a r e s u l to fa g i I l gD I n tJ P r o s t h o d o n t ,1 9 9 9 ,1 2 ( 6 ) :4 9 8 5 0 4 E 7 3 K o u y o u m d j i a nJ ,C h a l i a nV A ,M o o r eB K Ac o m p a r i s o no ft h ep h y s i
16、 c a lp m p e r t y e so far o o mt e m p e r a t u r eV u l c a n i z i n gs i l i c o n em o d i f i e d a n da n m o d i f i e d J JP r o s t h e tD e n t ,1 9 8 5 ,5 3 :3 8 8 8 P o l y z o i sG L ,H e n s t e n P e t t e r s e nA ,K u l l m a n nA A na s s e s s m e n to f t h e p h y s i c a lp
17、 r o p e r t i e s a n d b i o c o m p a t i b i l i t y o ft h r e es i l i c o n e e l a s t o m e r D 口JP r o s t h e tD e n t ,1 9 9 4 ,7 1 ( 5 ) :5 0 0 一5 0 4 9 L e w i sD H ,C a s t l e b e r r yD J A na s s e s s m e n to fr e c e n ta d v a n c e si n m a x i l l o f a c i a lp r o s t h e t
18、 i cm a t e r i a l s J JP r o s t h e tD e n t ,1 9 8 0 ,4 3 :4 2 6 4 3 2 收稿日期:2 0 0 8 埘一2 9 万方数据 - 3 4 2 - 临床口腔医学杂志2 0 0 8 年6 月第2 4 卷第6 期JC l i nS m m a m I J u n ,2 0 0 8 ,V 0 1 2 4 N o 6 骨组织在机械刺激作用下,依赖高度协调的细胞 活动不断地完成再生和吸收的重建过程,这个过程受 许多生物化学因子和激素调节h i 。近年研究发现环氧 合酶一2 ( c y c l o o x y g e n a s e 一
19、2 ,C O X 一2 ) 在骨骼重建、骨质吸 收以及成骨细胞力学信号转导等过程中扮演着重要角 色,节律性液体流、流体力、机械牵拉等机械刺激均能 引起成骨细胞C O X 一2m R N A 高水平表达,进而致前列 腺素产生增加,激活成骨细胞内多条信号转导通路 2 刮, 但其力学信号转导机制尚不清楚。本实验模拟牙槽骨 在功能活动中,细胞外环境压力的变化这一生理过程, 给离体原代培养的大鼠牙槽骨成骨细胞提供持续或间 歇性静压力作用,使成骨细胞在压力变化过程中发生 形变,观察这一条件对牙槽骨成骨细胞C O X 一2 蛋白表 达的影响,以研究C O X 一2 基因表达与成骨细胞力学信 号转导的关系,探
20、讨压力刺激对牙槽骨吸收和新生的 影响机制。 材料和方法 1 材料 a M E M 培养基( G i b c oB R L ,U S A ) ,胎牛血清( 浙江省金华 清湖犊牛利用研究所) ,1 I 型胶原酶( S i g m aC o ,U S A ) ,胰蛋白酶 ( G i b c o ,U S A ) ,可调压式细胞培育箱( 自行研制,该培育箱与压缩 混合气气瓶相连接,气瓶中为含7 0 2 、1 7 C 0 2 、9 1 3 N :的混合 气体) 引。 2 方法 2 1 细胞来源取出生1d 的S D 仔鼠牙槽骨,用0 2 5 胰 蛋白酶和1m g I I l l 型胶原酶( 0 O l M
21、P B S 配制) 二步酶消化法 分离细胞,用a M E M 培养液混悬均匀后接种于2 5m l 培养瓶, 置于3 7 、5 C O :恒温孵箱中培养。1 0m i n 后,轻轻倾斜吸出培 养液,再接种至第二瓶中,重复处理如同第一瓶,最后接种于第 三瓶中,3 7 、5 C O :恒温孵育箱中培养。接种后第3d 换液,约 长满8 0 传代。根据形态学观察、A L P 活性检测和V o n c o s s a 染 色法确定培养的细胞有成骨活性后,取第3 4 代细胞作为实验 对象。 2 2 压力刺激实验取同批培养的牙槽骨细胞,0 2 5 胰蛋 白酶消化,制备单细胞悬液,以5 1 0 5 m l 的浓
22、度接种在已置有 1 0c m 1 0c a 盖玻片的2 4 孔培养板,同时以1 1 0 6 I I l l 的浓 度接种5 0I I l l 一次性培养瓶,3 7 、5 C O :恒温孵箱中培养2 4 h 。观察细胞贴壁后,随机将培养板和培养瓶分成持续性静压力 组和间歇性静压力组,将培养板和培养瓶置入可调压式细胞培 育箱中,持续性静压力组给予3 0k P a 持续性静压力作用0h 、l h 、3h 、6h 。间歇性静压力组给予3 0k P a 、0 5H z 间歇性静压力作 用0h 、1 h 、3h 、6h 。 2 3 免疫细胞化学检测将压力刺激作用后的长有细胞的 盖玻片固定后,分步滴加兔抗大
23、鼠C O X 一2 多克隆抗体( C a y m e n , U S A ) 、生物素标记二抗和链霉素抗生物素酶一过氧化物酶( 迈新 生物工程有限公司) 溶液孵育;D A B H 2 0 :( 迈新生物工程有限公 司) 显微镜下控制显色5 1 0r a i n ,常规脱水、透明,加拿大中性树 胶封片。同时设0 叭MP B S 代替一抗作阴性对照。免疫细胞化学 染色结果以胞浆细胞问质无棕色反应为阴性( 一) 、出现淡棕色 为可疑阳性“一) 、棕色为阳性( + + ) 、深棕色为强阳性( + + ) 。 2 4 图像分析应用H P I A S I O O 高清晰度彩色病理图像 分析仪,按实验分组先
24、取经免疫细胞化学染色的细胞甩片l O 张,在不同的甩片中先取空白区,测定背景灰度值,然后在每张 甩片上随机选取7 1 5 个细胞,统一放大3 3 4 0 倍,用鼠标描绘 所测细胞胞浆区域,计算机自动进行测量,获得每层细胞的平均 灰度值。运用S P S Sl1 0 统计软件对不同实验组细胞的平均灰度 值进行统计学分析,了解不同实验组细胞C O X 一2 阳性表达的差 异。 2 5 蛋白质的定量和W e s t e r nb l o t 检测取压力刺激作用 后的细胞,提取细胞总蛋白;采用B r a d f o r d 法确定蛋白质含量, 根据得到的蛋白质含量,将蛋白质样品稀释定量为均一浓度,备 电
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