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1、不育症患者精子尾部超微结构改变的观察 党连凯1 ,陈生2 ,巫广腾1 ,姜琳2 ,王彤2 一 ( 1 中国科学院生物物理研究所,北京1 0 0 1 0 1 ;2 北京首都医科大学中医药学院附属鼓楼中医医院北京1 0 0 0 0 9 ) 4 6 9 【摘要】 目的观察男性不育患者精子尾部超微结构改变,探讨精子运动障碍导致男性不育的机理。 方法选择男 性不育精液,制备精子超薄切片、冷冻蚀刻复型膜和表面喷鎏样品,在透射电子显微镜和扫描电子显微镜下观察。 结果 1 精子尾部线粒体排列紊乱,外膜内嵴破裂;2 密纤维分离,密纤维与轴丝二联管颠倒,轴丝二联管缺损,放射辐、近邻连接断 裂,内外动力臂缺损;3
2、膜结构凹凸不平,膜噩白脱落或凝聚等。结论精子尾部中段线粒体结构破坏是精子丧失运动能 力的关键;精子尾部轴丝密纤维等病理改变不能有效利用A T P ,导致精子死亡;不育患者精子均出现磷脂双分子层结构改变 和膜蛋白变性造成的脱落和凝聚。 【关键词】男性不育症;精子尾 超微结构;超薄切片;冷冻蚀刻 【中图分类号1 R 4 4 6 8R 3 7 8 【文献标识码】A【文章编号 1 0 0 4 - 3 8 4 5 ( 2 0 0 8 ) 0 6 0 4 6 9 0 5 O b s e r v a t i o no Ht h eu l t r a s t r u c t u r ec h a n g e
3、so fs p e r mt a i lo fi n f e r t i l em a l e D A N GL i a n - k a i l ,C H E NS h e n 9 2 ,W UG u a n g t e n 9 1 ,J I A N GL i n g2 ,W A N GT o n 9 2 1 I n s t i t u t eo fB i o p h y s i c s ,A c a d e m i aS i n i c a ,B e t i i n g1 0 0 1 0 1 2 B e i j i n gG u l o uH o s p i t a lo fT r a d
4、i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e ,C a p i t a lM e d i c a lU n i v e r s i t y ,B e i j i n g1 0 0 0 0 9 A b s t r a c t O b j e c t i v e :T oo b s e r v et h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e so fs p e r mt a i lt os t u d yt h em e c h a n i s mo fm a l es t e r i l i t y M e t h o d
5、s :S e m e ns a m p l e sf r o mi n f e r t i l em e nw e r ec o l l e c t e d ,a n dt h e u l t r a t h i ns e c t i o n sa n df r e e z e - f r a c t u r er e p l i c a so fs p e r mp r e p a r e da n do b s e r v e dw i t he l e c t r o nm i c r o s c o p e R e s u l t s :1 T h ea r r a n g e m e
6、 n to fm i t o c h o n d r i aw a sd i s o r d e r e d ,m e m b r a n ea n di n n e rr i d g ed i s r u p t e d ; 2 D e n s ef i b e r sw e r ea p a r t T h ep o s i t i o no fd e n s ef i b e r sa n da x o n e m a ld o u b l e t sw a sr e v e r s e d S o m eo f d o u b l e t sw e r el o s t a n dr
7、a d i a ls p o k ea n di n t e r d o u b l e tl i n kd i s r u p t e d D e f e c to fs i d e a r mo fd o u b l e tw a s o b s e r v e d 3 M e m b r a n ew a sn o ts m o o t h ,P r o t e i nm o l e c u l e si nm e m b r a n es h e do ra g g r e g a t e d C o n c l u s i o n s :S t r u c t u r ed a m
8、a g eo fm i t o c h o n d r i ao fs p e r mt a i li st h ei m p o r t a n tr e a s o nf o rt h ef u n c t i o n a l d i s o r d e r D i s r u p t i o no fa x o n e m ea n dd e n s ef i b e rm a yb et h ec a u s eo fm a l es t e r i l i t y D a m a g eo fm e m b r a n e s t r u c t u r ew a sa l w a
9、y sf o u n di nt h ep a t i e n t K e yw o r d s :M a l es t e r i l i t y ; S p e r mt a i l ;U l t r a s t r u c t u r e ; U l t r a t h i ns e c t i o n ;F r e e z ef r a c t u r er e p l i c a ( ,R e p r o dM e d2 0 0 8 ,1 7 ( 6 ) :4 6 9 4 7 3 ) 精子活动能力是完成受精过程的前提条件,精 子活动能力低下,尾部畸形,运动方向不规则等都能 导致不育,
10、所以临床以精子活率、活力等作为诊断不 育症的指标;世界卫生组织( W H O ) 1 规定精子活 率5 0 作为正常与不正常的界限,活力分为a 、b 、C 、 d 四级。不正常形态分为缺尾、短尾、多尾,中段肿 胀等。于1 6 7 7 年L e e w e n h o o k 首先观察到精子的 形态和运动。随着显微镜分辨率提高和制备技术改 进,对精子结构和运动的研究取得了巨大提高。 R o t h s c h i l d 2 1 和T r o l l 等 3 3 发表了相关论著。电子 显微镜技术应用于生物学领域之后,揭示了精子尾 部的精细结构。A f z e l i u s 和B a c c e
11、 t t i 4 根据精子结构 和分子生物学研究成果合著“精子细胞生物学”。在 基础研究取得进展的同时,也研究了不育患者精子的 病理表现。A f z e l i u s 等 5 观察到精子轴丝二联管动力 臂缺失可造成精子鞭毛不动综合征( K a r l a g e n e r 【收稿日期】2 0 0 8 - 0 1 2 4 ;【修回日期】 2 0 0 8 0 4 1 6 【作者简介】党连凯( 1 9 3 7 ) ,男,吉林省双辽县人,剐研究员, 生殖细胞生物学 万方数据 s y n d r o m e ) 。M u n d y 阳研究精子中段长度、直径与精 子活动的关系;k a o 等口3 证
12、明精子线粒体D N Am t t 4 9 7 7b p 缺失与精子活力负相关,徐晨等 8 3 及曹兴午 等 9 3 观察到解脲支原体影响精子运动。余铭清 等m 3 发现棉酚破坏精子线粒体;党连凯等1 1 3 观察精 索静脉曲张患者精子线粒体损伤。我们在临床常规 检测不育症患者精液及精子的过程中观察到精子尾 部形态病理改变可造成精子运动障碍导致不育,为 研究运动障碍机理,选择不育患者精液制备精子超 薄切片,冷冻蚀刻复型膜,在透射电子显微镜 ( T E M ) 下观察,部分样品进行扫描电子显微镜 ( S E M ) 观察,旨在探讨精子尾部超微结构改变与男 性不育的关系。 材料和方法 一、对象 研究
13、对象分组:( 1 ) 生育组:年龄2 5 3 5 岁,精 液常规检查正常,有生育,共2 6 例;( 2 ) 不育组:年龄 2 5 4 5 岁,结婚 2 年不育,常规检查1 0 ,0 0 0 例以 上,超微结构检查4 6 0 例。 二、方法 1 常规检测:手淫取精液,3 0m i n 后检查精液 量、p H 、粘稠度、颜色、脱落细胞;超微弱发光;精子 数量、活率、活动度、畸形率、存活时间、凝聚。 2 超薄切片制备观察:精液l ,5 0 0r m i n 离心, 1 5m i n ,弃上清,沉淀固定于2 5 戊二醛2h 以上, 二甲胂酸钠冲洗2 次,固定于1 锇酸3 0 4 0m i n ,缓 冲
14、液冲洗后系列酒精脱水,环氧丙烷过渡,E p o n 8 1 2 包埋剂包埋,3 5 。、4 5 。、6 0 聚合,超薄切片厚5 0 7 0n m ,醋酸双氧铀、S a t o s 铅液双染色,透射电子显 微镜( J E M - 1 0 0C X ,J E O L ,日本) 观察、拍照。 3 冷冻蚀刻复型膜制备观察:精液沉淀,固定于 2 5 戊二醛2h 以上,二甲胂酸钠冲洗后用3 0 甘 油生理盐水防冻处理1 2h ,置于样品台,送进冷冻蚀 刻仪( B A F - 4 0 0 D ,B a l z a s ,列兹敦士登) ,在低温 ( 一1 7 0 ) 高真空( 1 1 0 _ 6 m b a
15、r ) 条件下断裂蚀刻,喷 铂、碳,取出样品,用次氯酸钠腐蚀,重蒸馏水清洗, 4 0 0 目铜网捞取复型膜,在透射电镜观察拍照。 4 扫描电镜样品制备观察:精液鎏片,3 0 戊 二醛固定,系列酒精( 5 0 一1 0 0 ) 脱水,醋酸异戊酯 替换( 3 0 一7 0 一1 0 0 ) ,临界点干燥,取出样品, 喷金,扫描电镜( S E M - 3 5 D ,J E o L ,日本) 观察拍照。 结果 一、光学显微镜观察 正常精子头尾结构清晰,头部有细胞核、顶体, 尾部分中段、主段、尾段,长约4 5 5 0 肛m ,横切直径 0 2 o 5 弘m ,呈螺旋式快速前向运动。 不育患者病变精子形态
16、表现:( 1 ) 二头一尾、一 头两尾、三头两尾或多尾等;( 2 ) 精子尾卷缩,或质滴 不脱落;( 3 ) 精子尾断裂;( 4 ) 精子中段肿胀变形; ( 5 ) 精子密纤维裸露或轴丝裸露;( 6 ) 尾部折曲,成弯 勃子精子,反向运动或转圈;( 7 ) 精子尾表面有粘着 物,并相互粘附凝聚。精子运动能力和方向改变。 精子体外存活时间缩短,几小时到2 4h ( 正常为2 3d ,少数4d ) 。 二、电子显微镜观察结果 正常精子( 图1 ,2 ) ,精子尾部从精子头的后头区 植人窝开始,远侧中心粒向后延伸至尾尖,分为中段、 主段和尾段,头、尾之间有节柱,中段有1 0 1 3 圈螺 旋形排列的
17、线粒体鞘包裹密纤维和轴丝,主段以体环 与中段分开,有纤维鞘包裹密纤维和轴丝,尾段有轴 丝。密纤维和轴丝的横切面可见9 + 9 + 2 结构,轴丝 的9 条二联管有近邻连接互相围成圆形,每个二联管 以放射幅与两个中心微管连接,且每个二联管的A 管伸出内、外动力臂。尾部线粒体和纤维鞘外有磷脂 双分子层膜,表面光滑,P 面和E 面都有均匀分布的 蛋白分子颗粒,并可见规则排列的链条样结构。 不育患者精子( 图3 1 4 ,1 5 1 8 ) 可见如下特 征:( 1 ) 精子头尾形态变化:精子头部后头区出现 2 - - - 3 个植入窝( 图3 ) ,这是精母细胞分裂障碍造成 的一头三尾精子或一头二尾精
18、子,也有二头一尾或 三头一尾精子,节柱破坏出现头尾分离,或头尾垂直 畸形( 图5 ) 。( 2 ) 精子中段损伤表现:线粒体排列 不规则,失去螺旋形结构( 图4 ) ;线粒体堆积,中 段肿胀变形( 图6 ) ;线粒体脱落,密纤维或轴丝裸 露,尾变细( 图7 ,8 ,1 0 ) ;有解脲支原体或衣原体 感染的患者,微生物侵入排挤线粒体,位置颠倒 ( 图9 ) ;线粒体肿胀变形,外膜内嵴破坏基质流 失,出现大空腔;膜结构凹凸不平,膜蛋白分布不 均。( 3 ) 密纤维、轴丝9 + 9 + 2 结构破坏:密纤维 分离,均匀分布的密纤维分裂成两部分( 图1 1 ) ,即 9 、1 、2 3 、4 、5
19、、6 、7 、8 ,从圆形变为长圆形,常见于接 触射线,微波和高热的患者;密纤维和二联管颠倒 ( 图1 2 ) 可能是放射辐,近邻连接断裂造成;动力 万方数据 臂损伤:外臂缺损,内臂缺损,内外臂缺损;中央微 管损伤;放射辐,近邻连接损伤;轴丝排列紊乱 ( 图1 3 ,1 4 ) 。( 4 ) 尾部膜结构损伤:膜表面不光滑, 凹凸不平,膜蛋白分布不均,出现光秃区和蛋白密聚 区。( 图1 5 1 8 ) 。膜破裂中段出现线粒体裸露,主 段出现密纤维裸露或轴丝裸露( 图8 ) 。 讨论 一、精子尾中段线粒体结构破坏是精子运动障 碍的关键 我们在观察中发现精子活率低、活力下降或死 精子都存在线粒体损伤
20、,主要是两种形式:( 1 ) 线粒 体排列紊乱、堆积;线粒体丢失,数量减少,中段变 细,或轴丝裸露。( 2 ) 线粒体外膜内嵴破裂损伤,膜 蛋白变性,脱落或聚集,线粒体基质流失,出现空泡 样结构。线粒体结构破坏,必然丧失合成A T P 的 能力,造成精子运动能力障碍,这一结论符合 T o m b e s 等 1 2 和H u s z a r 1 3 1 提出的精子运动理论, 即:线粒体提供高能磷酸键;通过磷酸肌酸运输高能 磷酸键;运动装置利用高能磷酸键。 圈1 2 为正常精子。图l A :精子头尾部结构,尾部中段纵切可见线粒体、密纤维、轴丝。T E M 6 ,0 0 0 图1 B :精子 尾部
21、中段、线粒体螺旋形包裹密纤维和轴丝。T E M1 2 ,0 0 0 图2 尾部中段横切从外向内有线粒体,9 条密纤维,9 条二 联营、两个中心微营。T E MX 2 0 ,0 0 0 图3 4 不育患者精子T E M 图。图3 精子后头区有三个植入窝,发出三条轴丝 即三尾精子。T E M 1 5 ,0 0 0 图4 精子尾中段线粒体大小术均排列紊乱,有支原体侵入。T E MX 1 2 ,0 0 0 图5 颈部 节柱破坏,头尾脱节,相互垂直。T E M 1 2 ,0 0 0 万方数据 4 7 2 图6 中段纵切,线粒体排列紊乱,内嵴外膜均有破坏。T E M1 0 ,0 0 0 图7 中段纵切,大
22、部分线粒体脱落,密纤维 轴丝裸露。T E M1 0 ,0 0 0图8主段纵切,密纤维断裂轴丝裸露。T E M 1 2 ,0 0 0图9中段纵切,支原体等微生物 侵入中段,取代线粒体。T E M 1 5 ,0 0 0 图l o 中段纵切,线粒体大小不均。少数线粒体脱落。T E M 1 2 ,0 0 0 图l l 主段横切,9 条密纤维分离,成为9 、1 、2 和3 、4 、5 、6 ,7 、8 两部分,从园形变为椭圆形。T E M 2 0 ,0 0 0图1 2中段横切,4 号5 号密纤维与轴丝二联管颠倒,可能是放射幅,近邻连接断裂导致翻转。T E M 1 5 ,0 0 0 图1 3 中段线粒体紊
23、乱,密纤 维轴丝错位,放射幅、近邻连接断裂,动力臂消失。T E M 1 0 ,0 0 0图1 4 轴丝二联管排列紊乱颠倒,中心微管消失,密纤 维、轴丝、二联管排列颠倒,巾央长管消失。T E M 1 0 ,0 0 0图1 5 1 8 为不育患者精子冷冻蚀刻照片。图1 5中段,表 面邝凸不平,膜颈蛋白分布不均。F - T E M 2 0 ,0 0 0 嗣1 6 主段,膜蛋白轻度凝聚。F _ T E M1 5 ,0 0 0图1 7 主段膜 蛋白变性大量脱落,表面光秃,少量聚集成团。F - T E M2 0 ,0 0 0图1 8中段主段连接处膜蛋白脱落和聚集。F - T E M 2 0 0 0 0 万
24、方数据 二、精子尾轴丝密纤维是运动装置 B e c k e r 1 4 1 指出,从轴丝二联管向外伸展的动力 臂( d y n e i n ) 可水解A T P 释放高能磷酸键,它推动A 管与B 管相互滑动,精子运动。轴丝密纤维任何一 部分结构破坏,都能造成精子运动障碍。A f z e l i u s 等 5 观察缺少动力臂,精子不能活动,称谓k a r t a - g e n e r 综合征。冯北元等n 5 在研究棉酚造成精子活 力降低机理时也证明棉酚可抑制动力蛋白( d y n e i n ) 活性,使精子运动能力下降。我们对不育患者精子 的观察中见到密纤维分离,可见两部分,9 、1 、2
25、 3 、4 、 5 、6 、7 、8 ,密纤维与二联管颠倒,近邻连接断开,放射 辐消失,密纤维断裂,轴丝断裂,动力臂破坏等,这些 运动装置破坏,必然导致精子尾不能有效利用A T P 提供的高能磷酸键,将化学能转变为A 、B 管滑动的 机械能,造成精子运动障碍。 三、不育患者精子尾膜结构损伤是常见的病理 表现 精子膜结构是维持细胞内环境稳定的屏障,在 完整的结构状态下细胞才能发挥正常功能。细胞的 磷脂双分子层对外界物理、化学刺激因子非常敏感, 在不利的环境下,膜结构首先受到攻击,我们对不育 患者精液检测发现p H 偏低,超弱发光强度明显增 强,也就是自由基过多,这与膜结构损伤是一致的, 膜结构破
26、坏必然波及到线粒体、密纤维、轴丝,造成 精子运动障碍。 四、精子尾部损伤的原因 各种物理、化学、生物、遗传、内分泌等因素都可 造成精子尾部损伤。r 射线、中子、微波、高热等容 易造成线粒体破坏和密纤维分离,即9 、1 、2 3 、4 、5 、 6 、7 、8 两部分。苯酚、棉酚、雷公藤、烟酒过量等可 造成精子发生过程障碍,产生多头精子、多尾精子、 无头精子或尾部多处断裂。受到解脲支原体、衣原 体或细菌感染后,逆行感染发展到睾丸引起精子发 生障碍,产生大量畸形精子,附睾炎者死精子过多。 排出的精子表面粘着物过多,出现弯勃精子、卷尾精 子、活力下降、逆行或转圈。感染后精子活动障碍的 原因是:( 1
27、 ) 生精过程障碍畸形精子增加;( 2 ) 微生物 破坏线粒体,合成A T P 能力下降;( 3 ) 线粒体膜细 胞膜破裂A T P 流失;( 4 ) 解脲支原体等缺乏线粒 体,寄生于细胞内,竞争性夺取精子的A T P 能量; ( 5 ) 微生物粘附于精子表面,负荷加重,运动速度下 降、方向改变。 有些不育患者受到外界因素影响,如厨师、出租 司机、电焊工、装修工、娱乐业人员等特殊职业,物 理、化学、生物因素,可同时并存,故需认真分析。 【参考文献l 1 1 3W H O :W H O 人类精液及精子一宫颈粘液相互作用实验室检 验手册 S 北京t 科学出版社,1 9 9 4 :5 - 1 0 2
28、 R o t h s c h i l d T h eh u m a ns p e r m a t o z o o n J B rM e dJ 1 9 5 8 ,1 ( 5 0 6 6 ) l3 0 1 3 T r o l lJ ,G o l j i e h e rj w Q u a n t i t a t i v ee v a l u a t i o no ft h em o t i l i t y o fs p e r m a t o z o a J F e r t i lS t e r i l ,1 9 6 2 ,1 3 1 7 2 8 3 4 A f z e l i u sB A ,B
29、a c c e t t i1 3 0 T h eb i o l o g yo tt h es p e r mc e l l M S w :t z e r l a n d :K a r g e r ,1 9 7 6 1 6 5 8 0 5 蚴鹏B A ,E l i a 姗n R ,J o l m m m 0 ,e ta 1 L a c ko fd y n e i n 删 i ni m m o t i l eh u m a n 印础 JC e l lB i o l ,1 9 7 5 ,6 6 ( 2 ) :2 2 5 - - 2 3 2 C 6 M u n d yA J A s t h e n o
30、 z o o n s p e r m i aa n dh u m a ns p e r mm i l d - p i e c e 口 H u mR e p r o d ,1 9 9 5 ,1 0 ( 1 ) 1 2 7 - 2 9 7 K a oS H ,C h a oF I T ,W dY H M i t o e h o n d r i a ld c o x y r i b o n u d d ca d d 4 9 7 7b pd e l e t i o ni sa s s o c i a t e dw i t hd i m i n i s h e df e r t i l i t ya n
31、 dm o t i l i t y o fh u m a ns p e r I n J B i o lR e p r o d ,1 9 9 5 ,5 2 ( 4 ) 1 7 2 9 - 7 3 4 8 徐晨,叶元康,王一飞,等解脲支原体与男性不育 J 生殖 医学杂志,1 9 9 2 ,1 ( 1 ) 2 0 - 3 3 9 曹兴午,曹育爱脲原体感染对精子运动的影响 J 性学, 1 9 9 4 ,3 ( 4 ) :2 4 - 2 6 1 0 3 余铭清,胡艳群。刘子龙,等醋酸棉酚对大鼠皋丸作用的超微 结构观察 C 北京:国际棉酚生育研究学术讨论会1 9 8 6z 8 0 1 1 党连凯,曹坚,鲁
32、崎晤精索静静脉曲张不育者精子的电镜观 察 J 生殖与避孕,1 9 8 5 ,5 ( 4 ) :5 5 5 8 1 z T o m b e sR M ,S h a p i r oB M M e t a b o l i t ec h a n n e l i n gz ap h o s p h o r y lc r e a t i n es h u t t l et om e d i a t eh i g he n e r g yp h o s p h a t et r a n s p o r tb e t w e e ns p e r mm i t o c h o n d r i o na n d
33、t a i l J C e l l ,1 9 8 5 ,4 1 ( 1 ) :3 2 5 3 3 4 1 3 H m z a rQC r e a t i n ek i m s ei nh u m a nS p e r m a t o z o a M L o n d o n : L i b b e y8 LC o m p a n yL t d 。1 9 9 7 :1 8 3 - 1 9 5 1 4 P e c k e rw M T h ew o r l do ft h ec e l l M S a nF r a n c i s c o lT h e B e n j a m i n ,C u m m i n g sP u b l i s h i n gC o m p a n y ,i n c ,1 9 8 8 : 6 8 0 - 6 8 4 1 5 冯北元,徐慕禹棉酚对海胆精子鞭毛轴丝及动力蛋白 ( d y n e i n ) A T P 酶的抑制的作用 J 动物学报,1 9 8 8 ,3 4 ( 1 ) :1 - 5 万方数据
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