中国大陆首例人感染高致病性禽流感病毒H5N1病例的实验室诊断.pdf
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1、中华实验和临床病毒学杂志2 0 0 6 年6 月第2 0 卷第2 期C h i n e s e J E x p C l i n V ir o l , J u n e 2 0 0 6 , V o l 2 0 , N o . 2 论 著 中国大陆首例人感染高致病性禽流感病毒( H S N 1 病例的实验室诊断 董婕 李中杰 张红刘运芝 陈裕旭郭元 张烨王敏余宏杰杨维中徐翠玲向妮娟 吉李德新李俊华王宇舒跃龙 摘要】 目的对2 0 0 5 年 1 0 月湖南省湘潭市湘潭县发生的一名不明原因肺炎病例进行实验室 检测, 以确定导致该病例的主要病因。方法采集病例呼吸道标本以及血清标本, 对呼吸道标本利用 分
2、子鉴别诊断技术以及 R T - P C R和实时荧光定量R T - P C R检测病毒核酸; 通过血凝抑制试验以及微量 中和试验检测血清中的特异性抗体。结果该病例所有的呼吸道标本 H 5 N 1 病毒特异性核酸及病毒 分离均为阴性。红细胞凝集抑制及微量中和实验显示, 恢复期血清较急性期血清 H 5 N 1 特异性抗体 阳转并且有4 倍以上增高。结论通过实验室检测结果分析, 该病例为中国大陆第一例人感染高致 病性禽流感病毒( 1-15N1)实验室确诊病例。 【 主题词】 禽流感; H 5 N 1 亚型; 不明原因肺炎; 实验室检测 L a b o r a t o r y d i a g n o
3、s e s o f t h e fi r s t c o n fi r m e d h u m a n c a s e o f a v i a n i n fl u e n z a A ( H 5 N 1 ) i n t h e m a i n l a n d o f C h i n a D O N G J ie , Z H A N G H o n g , L I U Y u n z h i , Z H A N G Y e , W A N G M i n ,Y U H o n g - j i e ,Y A N G W e i- t h o n g , X U C u i - l i n g ,
4、 X I A N G N i- j u a n , L I Z h o n g - j i e , C H E N Y u w x u , G U O Y u a 呼 , 口D e - x i n , L I J u n , h u a , W A N G Y u , S H U Y u e - t o n g .I n s t it u t e f o r V i r a l D is e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t io n C h i n e s e C e n t e r f o r D is e a s e C o n t r o
5、l a n d P r e v e n t i o n , S t a t e 梅 L a b o r a t o r y f o r I n f e c t i o u s D is e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n , B e ij i n g 1 0 0 0 5 2 , C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : S H U Y u e - l o n g , E - m a i l : y s h u 呻 . s i n a . c o m T e l : 0 1 0
6、- 6 3 5 7 7 4 9 9 A b s t r a c t O b j e c t i v e T o d e t e r m i n e t h e e t io l o g ic a g e n t a n a ty p ic a l p n e u m o n ia h u m a n c a s e a d m itt e d t o X i a n g t a n C i t y h o s p i t a l , H u n a n p r o v i n c e i n O c t . 2 0 0 5 . Me t h o d s T h e p a t i e n t
7、s r e s p i r a t o ry t r a c t s a m p l e s a n d s e r u m w e r e c o ll e c t e d . T h ro a t s w a b s w e r e t e s t e d w i t h M D D ( M o l e c u l a r D iff e r e n t ia l D i a g n o s t ic T e c h n o l o g y ) , R T - P C R a n d R e a p T i m e R T - P C R . T h e s e r u m s p e c
8、 i m e n s w e r e t e s t e d b y m i c ro n e u t r a l i z a t i o n a n d h e m a g g l u t i n a t i o n - i n h i b it i o n a s s s a y s . R e s u l t s T h e r e s u l t s o f n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n o f a ll r e s p i r a t o ry s a m p l e s w e r e n e g a t i v e a n d v
9、 i r u s i s o l a t i o n w a s a l s o n e g a t i v e . T h e H 5 - s p e c i f i c a n t i b o d i e s o f c o n v a l e s c e n c e s h o w e d a 4 - f o l d g r e a t e r r i s e t h a n a c u t e p h a s e . C o n c l u s i o n T h e a t y p i c a l p n e u m o n i a s c a s e w a s c o n f i
10、 r m e d a s t h e f i r s t h u m a n c a s e o f a v i a n i n fl u e n z a A( H 5 N 1 ) i n f e c t i o n i n t h e ma i n l a n d o f C h i n a . K e y w o r d s A v ia n i n fl u e n z a ; H 5 N 1 s u b t y p e ; A ty p ic a l p n e u m o n ia c a s e ; l a b o r a t o ry d i a g n o s i s 自2 0
11、 0 3 年以来全球共有7 个国家发生了人感 染高致病性禽流感病毒病例, 共有 1 6 9 人感染, 其中 9 1 人死亡 。 我国 在2 0 0 5 年1 0 月以前尽管发生了 多起动物疫情, 但是一直没有人感染高致病性禽流 基金项目: 国家自 然科学基金资助( 3 0 5 9 9 4 3 3 ) 作者单位: 1 0 0 0 5 2 北京, 中国疾病预防控制中心病毒病所, 传 染病预防控制国家重点实验室( 董婕、 张烨、 王敏、 徐翠玲、 郭元吉、 李 德新、 舒跃龙) ; 湖南省疾病预防控制中心( 张红、 刘运芝、 陈裕旭、 李 俊华) ; 中国疾病预防控制中心( 余宏杰、 杨维中、 向妮
12、娟、 李中杰、 王 宇) 通讯作者: 舒跃龙, 电话: 0 1 0 - 6 3 5 7 7 4 9 9 , E - m a i l : y s h u v i p . s i n a . c o m 董婕、 张红对本文具有同等贡献, 同为第一作者 感病毒病例。2 0 0 5 年 1 0 月 1 9日, 湖南省儿童医院 通过中国不明原因肺炎监测系统网络直报了一例不 明原因肺炎, 随即湖南省疾病预防控制中心对病例 采集标本进行检测, 并将标本同时送中国疾病预防 控制中心病毒病所国家流感中心进行检测和复核, 本研究主要报告该病例的实验室检测结果以及在人 感染高致病性禽流感病毒病例中的意义汇 。 1
13、材料和方法 1 . 1 标本采集2 0 0 5 年 1 0 月 1 9日湖南省儿童医 院通过中国不明原因肺炎监测系统网络直报一名不 明原因肺炎病例, 该病例为一9 岁男童, 于 1 0 月 1 0 中华实验和临床病毒学杂志2 0 0 6 年6 月第2 0 卷第2 期C h i n e s e J E x p C l i n V i r o l , J u n e 2 0 0 6 1 V o l 2 0 , N o . 2 1 5 们nlll 22匡 0 川H3BYBV 日发病。湖南省疾病预防控制中心分别采集了该病 例病后第 8 , 9以及 1 7 天的咽拭子标本; 同时采集了 该病例病后第 8
14、 , 1 7 , 2 1 以及 2 7天的血清。具体采 集方法参考 中国流感/ 人禽流感检测实施方案 。 1 . 2 咽拭子标本的快速试剂盒检测咽拭子标本 采集后采用日 本爱思普林公司生产的S D i n fl u e n z a a n t i g e n d e t e c t i o n k it 试剂盒进行检测, 具体操作方法 参照试剂盒使用说明书。 1 . 3 咽拭子标本的的核酸提取标本的核酸提取 采用德国Q i a g e n 公司的R n a e a s y m i n i k i t 试剂盒, 具 体方法参照使用说明书。 1 . 4 标本核酸检测核酸检测分别采用 R T - P
15、 C R 和R e a l - t i m e R T - P C R 方法。所使用的试剂盒分别使 用德国 Q i a g e n公司的 O n e S t e p R T - P C R S y s t e m和 Q u a n t i T e c t S Y B R G r e e n R T - P C R和Q u a n t i T e c t T M P r o b e R T - P C R , 具体方法按照试剂盒使用说明书进行。 R T - P C R和R e a l - t i m e R T - P C R引物参见文献 3 0 1 . 5 病毒的分离培养采用 S P F鸡胚和
16、 M D C K细 胞分离培养的方法, S P F 鸡胚购自北京实验动物中 心, M D C K细胞为国家流感中心保存。具体方法见 参考文献【 4 0 1 . 6 R T - P C R产物的纯化和序列测定及分析R T - P C R 产物的纯化按照德国Q i a g e n 公司的Q i a q u i c k G e l E x t r a c t i o n K i t 试剂盒的使用说明书进行。序列 测定使用 P E公司的 B ig D y e T e r m i n a t o r S e q u e n c i n g K i t , 在A B I 公司的M e g a B A C
17、E 进行。序列分析采用 D N A S T A R M e A / C h i c k e n / H u n a n x i a n g ta n - H e / 2 1 / 2 0 0 5 ( H 5 N 1 ) 由 哈尔滨兽医研究所提供。 3 份咽拭子标本经 R T - P C R和 R e a l - t i m e R T - P C R 检测, 结果全部为阴性。 2 . 3 病毒分离培养结果 3 份咽拭子标本接种 9日龄 S P F 鸡胚和 M D C K 细胞, 并且盲传 3代, 培养产物经血凝试验和 R T - P C R 检测全部为阴性。 2 . 4 血清血凝抑制试验测定结果
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