丹参酮ⅡA对LPS等诱导的肝细胞损伤及枯否细胞释放细胞因子的作用.pdf
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1、丹参酮A 对 LPS 等诱导的肝细胞损伤及 枯否细胞释放细胞因子的作用 胡咏武, 王胜春, 李 哲 (第四军医大学西京医院药剂科, 陕西 西安 710032) 收稿日期: 2005 -06 -09, 修回日期: 2004 -08 -30 作者简介: 胡咏武 (1970 - ) , 女, 技术员, 研究方向: 中药药理和药效 作用基础物质, Tel: 029-82540986, E-mail: huyongwu146 sohu. com. cn; 王胜春 (1952 - ) , 男, 主任药师, 研究方向: 中药药理和药 效作用基础物质, E-mail: wangshen fmmu. edu.
2、com. cn 中国图书分类号: R-332; R 282. 71; R 284. 1; R 322. 47; R 329. 24; R 392. 12; R 575. 02; R 575. 053 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2005) 12 -1482 -05 摘要: 目的 研究丹参酮A (TSH A) 对枯否细胞 (kupffer cell, KC) 释放细胞因子致肝细胞损伤的影响, 以探讨丹参治 疗慢性肝病的机制。方法 分离肝细胞和 KC 并建立 D- GlaN、 LPS 损伤肝细胞模型, 测定培养上清中 ALT、 MAO、 LDH-L、 GSH-ST、 MD
3、A,LPS 作用 KC 释放细胞因子同时放免 法测定 TNF-、 IL-6、 IL-8, HE 染色观察细胞形态, 免疫组化 法观察 TNF-、 CD14、 iNOS、 eNOS 在细胞内表达, 双层小室 培养观察 LPS 刺激 KC 释放细胞因子对肝细胞的损伤。结 果 TSh A 能修复 D-GlaN 和 LPS 诱导损伤的肝细胞, 反 映肝细胞损伤的酶水平和 MDA 明显低于 D-GlaN 和 LPS 组, 能明显抑制 LPS 诱导 KC 分泌 TNF-、 IL-8, 100ngL -1升高 IL-6 作用。TSh A 尚能抑制 KC 表达 TNF-、 CD14、 iNOS、 eNOS,
4、并有效地抑制 KC 释放过量的细胞因子损伤肝细胞, 但对细胞因子所致肝细胞损伤无直接保护作用。结论 TSh A 抑制 D-GlaN、 LPS 损伤肝细胞作用机制与有效抑制 KC 释放过量的细胞因子参与肝损伤有关。 关键词: 丹参酮A, 细胞因子, 肝细胞, 内毒素 丹参酮A (TanShinone A,TSh A ) 是丹参 有效成分之一, 对炎症、 期及急性和亚急性炎症 有良好治疗作用, 对期炎症无效 1。TShA 为 一种有效的细胞内脂质过氧化物与 DNA 相互作用 抑制剂, 能消除心肌线粒体膜脂质过氧化过程中产 生脂质自由基, 从而保护线粒体的吸收功能 2。本 文通过体外观察 TSh A
5、 对脂多糖 (LPS) 和 D-氨基 半乳糖 (D-GlaN) 诱导的肝细胞损伤和 KC 释放因子 的影响, 以探讨丹参治疗肝病的机制。 1 材料与方法 1.1 材料 SD 大鼠, , 由第四军医大学动物中心 提供, 动物合格证号: 医动证字 SC K (军) 2002-05; RPMI Medium 1640 培养基 (批号: 1080385, USA. GIBCO 公司产品) ; 新生牛血清 (FBS) 购自杭州四 季青, 批号: 200206112, 用前灭 56 , 30 min; 脂多 糖 (LPS) : USA SIGMA 公司提供; 肿瘤坏死因子- (TNF-) 、 白细胞介素
6、6 (IL-6) 、 白细胞介素 8 (IL- 8) 放免试剂盒, 北京北方生物技术研究所产品; 丙 氨酸氨基转移酶 ( ALT) 、 天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 、 碱性磷酸酯酶 (ALP) 试剂盒由北京中生北 控生物科技股份有限公司生产; 丙二醛 (MDA) 、 一 氧化氮合酶 (NOS) 试剂盒由南京建成生物工程研究 所生产; Rabbit anti-CD14、 Rabbit anti- TNF-a 、 Rabbit anti-NOS (iNOS) 、 Rabbit anti-NOS (eNOS) 一抗 武汉博士德生物工程有限公司产品; S-P 超敏试剂 盒由福州迈新生物技术有限公司
7、生产; 丹参酮A (TSh A ) : 纯度 99%, 由本室分离制备。 1. 2 供试液的制备 10%、 20% RPMI 1 640 及 DMEM/ F12 培养液: 分别取灭活小牛血清 10 或 20 ml 加 90 或 80 ml RPMI 1640 或 DMEM/ F12 配成相 应浓度。LPS 贮备液: 精密称取 LPS 1. 0 mg, 加 10% DMEM 培养溶解至 10 ml, 微孔滤膜除菌,- 20冷藏, 备用; 20 gL -1 LPS 供试液: 取 LPS 贮 备液加 10% DMEM 培养液稀释至 20 gL -1, 临 用现配; 60 gL -1 LPS 供试液:
8、 取 LPS 贮备液加 10% RPMI 1640 培养液稀释至 60 gL -1, 临用现 配; TSh A 供试液: 精密称取 TSh A 对照品 1 mg, 加 DMSO 溶解制成 1 gL -1的贮备液, 用时取 1 gL -1的贮备液加 10% DMEM 培养液稀释至终浓 度为 (100、 50、 25 mgL -1) 作为肝细胞和 KC 试验 药物。 1. 3 大鼠原代肝细胞分离与药效试验 取 12 wk 龄大鼠 3 只, , ip 25%乌拉坦 2 ml 麻醉, 按文献 3 操作制备原代肝细胞并进行试验; 肝细胞修复试 验: 制备良好肝细胞置 24 孔板内, 分为 5 组, 每组
9、 8 孔; 对照组每孔加 10% DMEM 培养液; D-GlaN 或 LPS 损伤组和 TShA 100、 50、 25 mgL -1 3 组各加 含 0. 5 mmolL -1 D-GlaN 或 20 gL -1 LPS 的 l0% DMEM 培养液, 置 37, 5% CO2孵箱中培养 24h, 800 rmin -1离心 5 min (4) , 吸弃上清液, 全 2841中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec; 21 (12) : 1482 6 部试验组经无血清 DMEN 培养液漂洗 1 次, 800 r min -1离心 5
10、 min (4) , 吸弃洗涤液, 对照组、 损伤 组加 10% FBS-DMEM/ F12 培养液, TShA 3 组加 试验药物供试液1 ml孔 -1, 继续培养24 h, 取培养 上清测定 ALT、 MAO、 LDH-L、 GSH-ST、 MDA。肝 细胞保护试验: 分组同上, 对照组、 损伤组加 10% FBSDMEM/ F12 培养液; TShA 3 组加试验药物供 试液 1 ml孔 -1置 24 孔板内, 37, 5% CO 2孵箱中 培养 24 h, 吸弃上清液, 全部试验组经无血清 DMEN 培养液漂洗 1 次, 800 rmin -1离心 5 min (4) , 吸 弃洗涤液
11、, 对照组加 10% FBS-DMEM/ F12, 损伤组 和 TShA 3 组各加含有 0. 5 mmolL -1 D-GlaN 或 20 gL -1 LPS 的 10% FBS-DMEM/ F12 培养液 1 ml/ 孔, 继续培养 24 h, 取上清液测定 ALT、 MAO、 LDH-L、 GSH-ST、MDA。 1. 4 TNF-、 IL-6、 IL-8 测定 取体重为 150 200 g SD 大鼠 3 只, 按文献 4制备 KC 经反复传代纯化 后用于试验。取 24 孔培养板 2 块, 每孔接种纯化 KC 悬液 1. 0 ml (每 ml 含细胞数约 1 106) , 置 37,
12、5% CO2孵箱内培养使细胞长成单层, 分组: 对照组、 损伤组、 TShA 2 组 (100、 50 mgL -1) , 每 组8 孔, 对照组、 损伤组加完全培养液, TSh A 2 组 分别加含相应 TShA 供试液 1 ml, 继续培养 24 h, 弃除培养上清, 对照组加完全培养液, 损伤组、 TSh A 2 组加含 LPS 的完全培养液 1 ml, 继续培养 8 h, 收集各组细胞上清至 - 80 保存, I125测定含量。 另取24 孔板每孔加入 (8 8)mm 玻片1 张, 同上试 验方法操作, 轻轻取出各孔细胞爬片, 置 PBS 缓冲 液洗涤 2 次, 置冷丙酮固定后 -20
13、保存。 1.5 HE 与免疫组化染色 取 KC 玻片进行 HE 染 色, 再取 KC 玻片行 TNF-、 CD14、 iNOS、 eNOS 链霉 菌抗生物素-过氧化物酶免疫组化染色, 细胞分别与 抗 CD14、 TNF-、 iNOS、 eNOS (1: 100) 进行孵育, 阴 性对照片用 PBS 替代一抗, 按试剂盒操作说明进行 免疫组化反应, 用二氨基联苯胺 (DAB)- 0. 3 ml H2O2/ L 系统显色 10 min。苏木素衬染、 脱水透明 后, 中性树胶封片。结果评定: 标本无明确阳性反应 者为阴性, 免疫组化阳性结果以 ( + ) 弱阳性 (计 1 分) 、($) 阳性 (计
14、 2 分) 、(%) (计 3 分) 强阳性 (&) 最强阳性 (计 4 分) 。 1. 6 细胞因子对肝细胞的影响 取 1. 5 项下 KC 调整细胞密度 1 1011L -1, 置双层培养小室下层 内, 37, 5% CO2孵箱内培养生长成单层进行试 验: 取生长良好单层细胞分成 3 组, 每组重复 6 孔, TShA 组加含 TShA 100 mgL -1 孵育液, LPS 组和正常组加孵育液, 培养 12 h, 吸弃上清; 正 常组加孵育液, TShA 和 LPS 组加每孔加 60 g L -1 LPS 供试液 1 ml 培养 3 h; 再取稀释成 1 1011 L -1的肝细胞悬液,
15、 加入上述各试验组 KC 培养小 室上层内, 每孔0. 5 ml, 继续培养8 h, 取上清液测定 ALT、 AST。分组与试验次数同上, 肝细胞与 TSh A 100 mgL -1共同培养 12 h, 离心收集细胞, 稀 释成 1 1011L -1的细胞悬液, 备用; 同时取生长良 好 KC, 正常组每孔加孵育液, LPS 和 TShA 组每孔 加 60 gL -1 LPS 供试液 1 ml 培养 3 h, 将经 TSh A 处理肝细胞悬液加入各试验组 KC 培养小室上 层内, 每孔 0. 5 ml, 继续培养 8 h, 取上清液测定 ALT、 AST。 1. 7 统计学处理 采用 SPSS
16、 10. 0 版统计软件, 所 测数据以-x s 表示, Tab 1、 2、 3、 4、 6、 8 用 Kruskal- wallis 秩和检验分析, Tab 5, 7 资料用单因素方差分析。 2 结果 2.1 对 D-GlaN 和 LPS 诱导肝细胞损伤的修复作 用 D-GlaN 和 LPS 能诱导肝细胞损伤, 反映肝细胞 功能酶谱水平和 MDA 急剧上升, TShA 组的酶谱 水平和 MDA 含量均明显地低于 D-GlaN 和 LPS 损 伤组 (Tab 1, 2) 。 2. 2 对 D-GlaN 和 LPS 诱导肝细胞损伤的保护作 用 结果表明先用 TShA 与肝细胞培养一定时 间, 再
17、分别用 D-GlaN 和 LPS 诱导肝细胞损伤, TSh A 显示明显的保护作用 (Tab 3, 4) 。 2. 3 对 LPS 诱导 KC 分泌 TNF-、 IL-6、 IL-8 的影 响 KC 经 LPS 诱导释放 TNF-、 IL-8 明显增加, 但 并不引起 IL-6 释放增加。TSh A 能明显抑制 LPS Tab 1 Restorable effect of Tashinone A on hepatocyte injuries induced by D-GlaN (-x s, n =8,nkt) GroupDose/ mgL-1ALTMAOLDHLGSH-STMDA/ nmolL
18、-1 Normal-934.5 101.7*35.7 15.0*850. 2 320. 0*948. 5 203. 41. 02 0. 2 D-GlaN0.05/ molL-12659.5 773.4274.7 80.04401. 4 916. 93405. 7 613. 54. 86 0. 5 TShA1001261.6 83.4*65.7 16.7*1973. 4 260. 0*2236. 1 341. 71. 50 1. 0 501495.3 635.1*49.3 18.3*1708. 7 766. 3*2563. 8 481. 83. 30 0. 8 251251.6 146.7*84
19、.7 16.7*1707. 7 598. 5*3969. 3 1153. 60. 72 0. 4 *P 0. 05,*P 0. 01 vs D-GlaN group 3841中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec; 21 (12) Tab 2 Restorable effect of Tashinone A on hepatocyte injuries induced by LPS(-x s, n =8,nkt) GroupDose/ mgL-1ALTMAOLDHLGSH-STMDA/ nmolL-1 Normal-934.5 101
20、.7*35.7 15.0*850. 2 320. 0*951. 9 203. 4*1. 02 0. 2* LPS0.022452.2 753.41683.7 23.32934. 9 430. 02468. 8 635. 17. 35 0. 8 TShA1001004.2 236.7*48.8 18.3*927. 7 113. 4*3120. 3 946. 92. 78 0. 2* 501557.1 510.1*78.8 16.7*1498. 6 540. 1*2319. 5 826. 83. 10 1. 2* 251262.4 126.7*96.9 10.0*1484. 3 530. 1*13
21、83. 3 273. 0*3. 72 1. 0* *P 0. 05,*P 0. 01 vs LPS group Tab 3 Protective effect of Tashinone A on hepatocyte injuries induced by D-GlaN (-x s, n =8,nkt) GroupDose/ mgL-1ALTMAOLDHLGSH-STMDA/ nmolL-1 Normal-642.8 103.4*19.0 3.3*921. 0 413. 4*1023. 5 281. 7*2. 52 0. 6* D-GlaN0.05/ molL-12548.8 520.1196
22、.5 21.72568. 2 333. 42668. 2 519. 97. 86 0. 6 TSh A100925.5 150.0*56.0 13.3*1838. 7 353. 4*1454. 5 143. 4*4. 02 2. 0 501267.9 103.4*78.7 23.3*1620. 7 286. 7*2125. 4 681. 8*2. 41 0. 8* 252210.4 320.050.5 10.0*2142. 3 715. 13582. 0 1388. 61. 97 1. 0* *P 0. 05,*P 0. 01 vs D-GlaN group Tab 4 Protective
23、effect of Tashinone A on hepatocity injuries induced by LPS(-x s, n =8, nkt) GroupDose/ mgL-1ALTMAOLDHLGSH-STMDA/ nmolL-1 Normal-571.1 183.4*27.2 20.0*921. 0 413. 4*1016. 4 276. 7*2. 52 0. 6* LPS0.021680.8 571.8179.7 21.72294. 1 406. 73320. 7 993. 57. 26 0. 9 TSh A100827.3 140.0*73.0 13.3*810. 2 71.
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