丹参酮ⅡA磺酸钠和丹参素对猪冠状动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的激活机制.pdf
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1、丹参酮A 磺酸钠和丹参素对猪冠状动脉平滑肌细胞 钙激活钾通道的激活机制 张洁1, 2*,曾晓荣1,杨艳1,刘智飞1 (1. 泸州医学院心肌电生理研究室,四川 泸州646000;2. 成都医学院 生理学教研室,四川 成都610083) 摘要:目的研究丹参酮A 磺酸钠 (DS-201) 和丹 参素 (DS-182) 的冠状动脉舒张作用除了已知的机制 外, 是否还与钙激活钾通道 (KCa) 有关。方法猪冠 脉平滑肌细胞贴附式和内面向外式膜片钳单通道电 流记录技术。结果DS-201 和 DS-182 均可激活冠 脉平滑肌细胞 KCa, 但 DS-201 在内面向外膜片方式 下激活 KCa; 而 DS-
2、182 在细胞贴附膜片方式下激活 KCa。结论DS-201 和 DS-182 激活 KCa的作用机制 不同。DS-201 能直接激活 KCa, 而 DS-182 则可能需 要一系列胞内过程。这种差异可能与二者的结构和 溶解性质不同有关。 关键词:丹参酮A 磺酸钠;丹参素;钾通道;肌, 平滑,血管;冠状血管;膜片钳技术 中图分类号:R972 文献标识码:A 文 章 编 号:1000-3002 (2005) 04-0270-04 钙激活钾通道 (calcium-activated potassium chan- nels,KCa) 是血管平滑肌上最主要的外向电 流 通 道 1。许多钾通道开放剂均作
3、用于 K Ca而舒张血 管。其调节 KCa的机制包括:直接激活 KCa, 如脂 溶性的吡那地尔 (pinacidil) 直接作用于通道内口激 活 KCa 1。通过胞内过程间接激活 K Ca, 参与这一 介导过程的第二信使有 cGMP,cAMP,Ca2 +等, 如心 钠素通过第二信使 cGMP, 降钙素基因相关肽通过 收稿日期:2004-10-17接受日期:2005-05-09 基金项目:国家自然科学基金资助项目 (39370270) 作者简介:张洁 (1970 - ) , 女, 四川省乐山人, 讲师, 医 学硕士, 主要从事心肌电生理研究;曾晓荣 (1955 - ) , 男, 教 授, 硕士生
4、导师, 研究方向为心肌电生理学。 *联 系 作 者 E-mail:zhangjiefa8888 126. comTel: (028) 86579120 cAMP, 乙酰胆碱通过 Ca2 +间接激活 KCa。有的药物 还通过 G 蛋白直接激活 KCa, 如异丙肾上腺素 2。 丹参是一味重要的活血化瘀药, 实验证明, 其两 个主要有效成分丹参酮A 磺酸钠 (sodium tanshi- noneA sulfonate,DS-201) 和丹参素 (danshensu,DS- 182) 均可增加冠脉流量, 其机制可能与阻滞钙内流 有关 3。据报道, DS-182 能激活心肌细胞内向整流 钾通道而具有保
5、护心肌的作用 4, 提示丹参对心血 管活动的影响可能不仅限于阻滞钙通道这一途径。 因为 KCa是冠脉平滑肌上最主要的外向电流通道, 与冠脉的舒张密切相关, 故本研究应用膜片钳技术, 研究 DS-201 和 DS-182 的冠脉舒张作用是否与 KCa 活动相关, 并比较其效应和作用机制。 1材料和方法 1.1仪器, 药品和试剂 日本 CEZ-2200 型膜片钳放大器;VC-11 型记忆 示波器;SEN-7203 型电子刺激器;PP-83 型微电极 拉制仪;IMT-2 型倒置相差显微镜。DS-201, 纯度 99.0%, 复旦大学附属中山医院制剂科提供; DS- 182, 纯度98.5%, 复旦大
6、学上海医学院天然药物 化学教研室提供; 四乙基铵 (tetraethylammonium chlo- ride, TEA) ,ATP,DIDS,EGTA,HEPES 为 Sigma 公司 产品;其他试剂均为分析纯。 1.2方法 取原代培养 5 4 10 d 的猪冠脉平滑肌细胞, 用 细胞贴附式和内面向外式两种膜片方式记录单通道 电流。单通道电流信号通过膜片钳放大器放大, 滤 波 (3 kHz) 后, 输入计算机, 用 pCLAMP6.0.2 软件系 统 (AXON INSTRUMENT) 进行数据采样并分析通道 活动的开放概率, 平均开放时间, 平均关闭时间和电 流幅值。所有实验均在室温 (2
7、0 24) 下进行。均 采用对称性高钾液 (140 mmol L - 1) 。电极液成分为 072 中国药理学与毒理学杂志 Chin J Pharmacol Toxicol 2005 年 8 月; 2005Aug; 19 (4) : 270 - 273 19 (3) : 270 - 273 (mmolL - 1) :天冬 氨 酸 钾 (aspartate-K, K-asp)40, KCl 100,HEPES 10, CaCl21,DIDS 0.1,ATP 2,pH 7.4; 细胞浴液成分为 (mmolL - 1) : K-asp 100,KCl 40,HEPES 10,EGTA 1,CaCl2
8、0.55,pH 7.4,浴液中 游离 Ca2 +浓度为 0.1mol L - 1。形成细胞贴附式或 内面向外式记录结构后, 在细胞浴液中加入 CaCl2, 并改变钳制电压, 确认为 KCa后, 先记录正常的通道 电流, 然后在浴液中以 10 min 间隔加入 DS-201 或 DS-182, 加药 3 min 后, 记录同一膜片同一通道, 在不 同药物浓度下的电流。最后观察 5 20 mmolL - 1 TEA 的阻断效应, 进一步确定所记录通道为 KCa。 1.3统计学处理 结果以-x s 表示, 采用配对 t 检验。 2结果 2.1细胞贴附式膜片下 DS-201 对 KCa的作用 在不同钳
9、制电压下, 向浴液中加入 5 30mol L - 1 DS-201 对通道活动均无明显影响。通道开放概 率和电流幅值在用药前后均无明显变化 (n = 5, P 0.05) 。 2.2内面向外式膜片下 DS-201 对 KCa的作用 在不同钳制电压下, 5 20molL - 1 DS-201 对 通道表现出明显的激活作用, 开放概率明显增加, 但电流幅值无明显变化。当膜电位为 + 20 mV, DS- 201 浓度分别为 5, 10, 15 和 20molL - 1时, 通道开 放概率分别增加了 5. 8, 12. 5, 12. 0 和 11. 1 倍 (图 1) , 且具有一定的浓度依赖性,
10、10molL - 1时即已 达到最大效应浓度。通道平均开放时间明显增加, 平均关闭时间明显减少 (表 1) 。实验中用药前后记 录的通道电流中无多水平开放。 Fig 1.Effect of sodium tanshinoneA sulfonate (DS-201)on calcium-activated potassium channels in a cultured porcine coronary artery smooth muscle cell at + 20 mV membrane potential from an inside-out patch exposed to symme
11、trical 140 mmol L - 1 K + and 0.1mol L - 1 Ca2 + i. The upward deflection indicated out- ward currents. DS-201 was added cumulatively from inner side of membrane and currents were recorded 3 min after drug addition. A: Control;B,C,D and E:DS-201 5,10,15 and 20mol L- 1. 2.3细胞贴附式膜片下 DS-182 对 KCa的作用 在不
12、同钳制电压下, 10 30mol L - 1 DS-182 对 通道表现出明显的激活作用, 而 5molL - 1 DS-182 对通道活动无明显影响。其激活效应表现为通道开 放概率和开放数目的增加, 但用药前后电流幅值无 明显变化。当膜电位为 + 70 mV 时, 10, 15, 20, 25 和 30mol L - 1 DS-182 能使通道开放概率分别增加 5, 15, 27, 31 和 30 倍 (图 2) 。利用 Boltzman 方程进行拟 合, 得半数有效浓度 (EC50) 为 15molL - 1。通道平 均 开放时间无明显变化 ( P 0.05) , 平均关闭时间 Tab 1
13、.Effect of DS-201 on calcium-activated potassium channels in porcine coronary artery smooth muscle cells in inside-out patches at + 20 mV membrane potential DS-201/mol L- 1nOpen probabilityTo/ msTc/ msAmplitude/ pA 060.06 0.032.11 0.45157.85 84.346.57 0.22 560.41 0.11*6.54 2.10*6.66 2.23*6.86 0.26 1
14、050.81 0.05*6.21 2.29*1.65 0.97*6.74 0.13 1540.78 0.09*4.01 1.20*1.02 0.07*6.60 0.28 2040.73 0.04*3.54 0.14*1.51 0.47*6.50 0.22 To:Mean open time;Tc:mean closed time.-x s . *P 0.05) 。 3讨论 DS-201 和 DS-182 是丹参的两个主要活性成分, 均具有舒张冠脉, 促进侧支循环建立等作用。本实 验采用膜片钳技术, 证实 DS-201 和 DS-182 均具有 激活原代培养猪冠脉平滑肌 KCa的作用, 这可能也
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