中国人CHRNA4基因的多态性分析.pdf
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1、 论著 中国人CHRNA4基因的多态性分析 张丽梅陈彪冯秀丽董秀敏王维治 【摘要】 目的对中国人神经型烟碱性胆碱能受体 alpha4 亚单位(CHRNA4)全基因进行扫描, 检测 CHRNA4基因多态位点及基因变异频率。方法随机抽取 100 名北京地区流行病学调查老年人和 100 例 原发性帕金森病患者 (从 2000 年至 2002 年首都医科大学宣武医院就诊的原发性帕金森病患者中随机抽 取) , 用 PCR 扩增CHRNA4的 6 个外显子及邻近内含子区。用变性高效液相色谱和限制性酶切片段长度多 态检测CHRNA4的多态位点, 测序确定变异的碱基, 统计各多态位点基因频率。结果检测出 10
2、 个 CHRNA4多态性位点, 420C/ T(0. 873/0. 127) ,870C/ T(0. 828/0. 172) ,1440A/ C(0. 858/0. 142) ,1860C/ T (0.738/0.262) ,1890C/ T(0.605/0.395) , 第 5 内含子 + 14T/ C(0.553/0.447) , 第 2 内含子 + 22G/ A (0.873/ 0.127) 与以往报道相同 (GenBank NM00074) 。新发现 3 个多态位点, 第 3 内含子 + 182 Del 22 bp(0.813/ 0.187) , 1758C/ T 和 1809C/ T
3、。帕金森病组第 3 内含子 + 182 Del 22 bp 缺失变异频率 (0.235) 高于对照组 (0.140)(P = 0.015) 。结论CHRNA4是高度多态的基因, 多态位点多在第 5 外显子。帕金森病患者第 3 内含子 + 182 Del 22 bp 缺失变异者多。 【关键词】 烟碱性胆碱能受体;CHRNA4基因; 遗传多态性; 帕金森病 Polymorphisms of neural nicotinic cholinergic receptor alpha 4 gene of Chinese*ZHANG Li-mei1, 2,CHEN Biao1,FENG Xiu-li1,DO
4、NG Xiu-min1,WANG Wei-zhi2. 1 (Department of Neurology,Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing,100053 P . R . China . Email:limeizhang70hot- mail. com) ; 2 ( Department of Neurology,the Second Hospital,Harbin Medical University,Harbin,Heilongjia
5、ng, 150086 P . R . China) Corresponding author:CHEN Biao, Email:pbchanbjsap . org 【Abstract】 ObjectiveTo screen for polymorphisms in alpha 4 subunit(principal subunit of nAChR)gene( CHRNA4) . MethodsDNA was extracted from leukocytes of all subjects including 100 healthy senior people and 100 patient
6、s with Parkinson s disease (PD) . The exons and adjacent intron regions ofCHRNA4were amplified with PCR. SNPs were screened by denatured high performance liquid chromatography (DHPLC)techniques and restriction fragment length polymorphisms. Potential mutations were confirmed by sequencing. ResultsTo
7、tal 10 polymorphisms were detect- ed and identified in coding and adjacent intron regions of nAChR alpha 4 gene,that are 420C/ T(0. 873/0. 127) , 870C/ T(0.828/0.172) ,1440A/ C(0.858/0.142) ,1860C/ T(0.738/0.262) ,1890C/ T(0.605/0.395) ,intron 5 + 14T/ C(0.553/0.447) ,intron 2 + 22G/ A(0.873/0.127)
8、,intron 3 + 182 Del22bp(0.813/0.187) ,1758C/ T and 1809C/ T(reference for coding sequence is GenBank SNPs 000744) ,of which the last three are novel mutations. PD patients appeared higher frequency of deletion in intron 3 + 182 (0.235)than normal controls(0.140)( P = 0.015) . ConclusionnAChR alpha 4
9、 gene is polymorphic. PD patients take higher frequency of intron3 + 182 Del 22 bp. 【Key words】 nicotinic acetylcholine receptor;CHRNA4gene; genetic polymorphisms; Parkinson s dis- ease *Supported by Grants from the National High-Tech R&D Project from the Ministry of Sciences and Technology(2002BA71
10、1A07- 04; 2002BA711A10) ,the Beijing Science and Technology Commission(955020500) ,and Beijing Municipal Bureau of Health(2002- 3011) 神经型烟碱性胆碱能受体 (nicotinic acetylcholine receptor,nAChR) 属于配体门控离子通道, 在人大脑皮 层, 海马, 丘脑, 纹状体广泛存在, 参与注意、 记忆和认 基金 项 目:国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划( 2002BA711A07-04; 2002BA711A10) ;北京
11、市科委项目 (955020500) ; 北京市卫生局首都发展 基金 (2002-3011) 作者单位: 100053 北京, 首都医科大学宣武医院神经内科 北京市老 年病研究所神经生物研究室 (张丽梅、 陈彪、 冯秀丽、 董秀敏) ; 哈尔滨医 科大学附属二院神经科 (张丽梅、 王维治) 通信作者:陈彪, Email: pbchan bjsap.org 知等功能, 并与神经变性病、 癫痫、 精神疾病和尼古丁 依赖等相关 1。 nAChR 有 8 个亚单位和 3 个亚单位, 亚单位 间组合构成不同亚型, 人脑 90%区域含42 亚型, 是 nAChR 的主要类型, 帕金森患者 (Parkinso
12、n s disease, PD) 、 Alzheimer 患者和孤独症者脑内 alpha4 亚单位减 少 2-4, 常染色体显性遗传性夜间阵发性额叶癫痫患者 中发现CHRNA4突变 5, 近期研究还证明 CHRNA4的 单倍型 “GCTATA” 与男性吸烟依赖相关 6。为进一步 研究中国人 alpha4 亚单位, 我们对CHRNA4基因进行 55中华医学遗传学杂志 2006 年 2 月第 23 卷第 1 期Chin J Med Genet,February 2006,Vol. 23,No. 1 扫描, 检测基因变异, 并统计中国人 CHRNA4 的基因变 异频率。 1对象和方法 1.1对象随机
13、抽取 2000 年北京地区流行病学调查 老年人 100 名, 男 52 名, 平均年龄 (67.65 4.88) 岁; 女 48 名, 平均年龄 (66.38 3.83) 岁。2000 年至 2002 年 在北京宣武医院就诊的帕金森患者 100 例, 男 68 例, 平均年龄 (57.75 9.41) 岁; 女 32 例, 平均年龄 (57.16 8.20) 岁。 1.2方法 (1) 提取基因组 DNA: 取静脉血 (2% ED- TA 抗凝) , 常规酚 / 氯仿法从白细胞中提取 DNA。 (2) 设计引物:CHRNA4基因位于 20 号染色体, 有 6 个外 显子, 其完整序列依据 Gen
14、Bank AL121827, 外显子序列 依据 GenBank NM0007444 及文献 7 。用 Primer Select 和 Oligo 软件设计CHRNA4外显子的特异引物 (表 1) 。 第 5 外显子含 1375 bp,设计引物 “eoxn 5” 扩增第 5 外 显子全长, 然后进行嵌套式 PCR 扩增。 (3)检测变异: PCR 扩增外显子及其邻近区域分别选用 Tag 酶、 pfu 酶、 TaKaRa LA; 用变性高效 液 相 色 谱 (denatured high performance liquid chromatography,DHPLC)筛选有变异 的片段, 测序确定
15、变异碱基。限制性酶切片段长度多 态 (restriction fragment length polymorphism,RFLP) 检测, 限制酶购自 Promega 公司。 2结果 2.1筛查CHRNA4基因多态位点检测到 10 个多 态位点: 420C/ T,870C/ T,1440A/ C,1860C/ T,1890C/ T, 第 5 内含子 + 14T/ C, 第 2 内含子 + 22G/ A 与以往报 道相同, 新发现 3 个变异: 第 3 内含子 + 182 Del 22 bp ( - / GGGCAGGGCCAGGGCAGGGCAG) ( GenBank 注 册 号: AY878
16、245) , 1758C/ T (GenBank 注册号: AY878243) 和 1809C/ T (GenBank 注册号: AY878244) 。仅 1 例发现 1758 杂合变异; 6 例 1809 位杂合变异, 1 例纯合变异。 2.2PD 组与对照组等位基因分布多数变异可通过 DHPLC 上波形变异判断基因型, 对 DHPLC 不能分辨的 870 和 1890 位点变异, 分别用 Hsp92I 和 CfoI Hsp92I 酶 切判断基因型, 并计算等位基因频率 (表 2) 。应用 Hardy-Weinberg 定律检验两组均达到遗传平衡, 并且第 3 内含子 + 182 多态位点有
17、无缺失两组差异有统计学 意义, PD 组有缺失者多于对照组 (P = 0.015) 。 2.3CHRNA4基因变异在 DHPLC 上的特点 2.3.1PCR 片段中含单个变异第 5 内含子 + 14, 1440 位变异是各自 PCR 片段中唯一的单碱基突变, DHPLC 表现为稳定的单峰和变异双峰, 据此判断基因 型 (未列图) 。第 3 内含子 + 182 Del 22 bp 杂合变异, 在 DHPLC 上表现为相距较远双峰 (图 1) 。 2.3.2PCR 片段中含 2 个变异第 2 外显子 420 与第 2 内含子 + 22 变异, 相距 61 bp, DHPLC 扫描表现为一 种形态稳
18、定的杂合, 纯合和野生型图形, 测序证实两者 是相连锁的两个变异。 2.3.3PCR 产物中含 3 个多态位点 (1) 第 5 内含子 + 14、 1890 和 1860 变异位于第 5 外显子及相邻区域, 相距 113 bp 和 30 bp, 用引物第 5 外显子-F 和第 5 外显 子-1c-R 扩增同在一个片段, DHPLC 呈多变的波形, 很 难确定各位点基因型, 测序证实三者不连锁, 分别设计 引物将 3 个变异拆分在 3 个片段第 5 外显子-1a, 第 5 外显子-1b, 第 5 外显子-1c。 (2) 第 5 外显子-1c 片段又 出现 3 种不同的波形 (图 2) , 测序发
19、现分别为 1860C/ T 和 1758C/ T、 1809C/ T 变异, 后两者出现变异时 1860 位 均为野生型。 表 1 引物及 PCR 产物特征 Table 1The characteristic of primers and PCR products Exon (外显子) Upstream primers (上游引物, 5-3) Downstream primers (下游引物, 5-3) Product size (PCR 产物长度, bp) Exon size (外显子长度, bp) Annealing Temp. and duration (PCR 退火温度)(时间) 1g
20、gtgcgtgcgccatggagc*gcagtcaggagcctgcctc*1797660 (30 s) 2cagcccgggccggacactcacagggcagcctggagagctcctggaca35815262 (1 min) 3gtcccagcgcagcttgtagtcgtgcctagggccagagaaagacaccaa4314559 (30 s) 4ccttggtggagctccctgtctgaacgtatgggtgaagcaggtgagt50811059 (30 s) 5gggcccggctcctggattacacatggacgtgggcatgggtgtggcag155913
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- 中国人 CHRNA4 基因 多态性 分析
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