乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活蛋白5基因的克隆化研究.pdf
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1、乙型肝炎病毒前- S 1蛋白反式激活蛋白5基因的克隆化研究 张健康 郭江 成军 王丹琼 赵龙凤 伦永志 蓝贤勇 洪源 毛羽 摘 要 目的 克隆乙型肝炎病毒(H B V) 前- S 1蛋白反式激活新基因P S 1 T P 5的c D N A, 并应用生物信息学技术初步探讨其结 构及功能。方法 应用聚合酶链反应(P C R) 技术以H e p G 2细胞的c D N A为模板扩增P S 1 T P 5, 以p G E M - T载体进行T A克隆, 通过 P C R、 限制性酶切分析及测序进行鉴定, 再将其亚克隆到真核表达载体p c D N A TM3 . 1 /m y c - H i sA, 通
2、过P C R、 限制性酶切分析进行鉴 定, 并应用生物信息学技术初步分析其物理化学性质、 蛋白质结构和功能。结果 P C R成功扩增出P S 1 T P 5基因, 并将其分别克隆进 p G E M - T和p c D N A TM3 . 1 /m y c - H i sA载体, 经P C R、 限制性酶切鉴定后测序证实。因其可以被前- S 1蛋白反式激活,故命名为前- S 1 反式激活蛋白5(P S 1 T P 5),已在G e n B a n k中注册,注册号:A Y 4 2 7 9 5 3。生物信息学分析确定其O R F为4 3 8个核苷酸(n t) , 编码产 物为1 4 5个氨基酸残基
3、( a a) 。结论 发现了H B V前- S 1蛋白反式激活新基因P S 1 T P 5, 构建了p c D N A TM3 . 1 /m y c - H i sA真核表达载 体, 为进一步研究其生物学功能及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。 关键词 肝炎病毒, 乙型; 前- S l蛋白; 反式激活; 基因,P S 1 T P 5; 克隆 中国图书资料分类号 R 3 2 9 . 2 C l o n i n go f h u m a ng e n e J t r a n s - a c t i v a t e db yp r e - U 1p r o t e i no f h e p a t i
4、 t i sGv i r u s Z h a n gJ i a n k a n g,G u oJ i a n g,C h e n gJ u ne t a l. I n s t i t u t eo f I n f e c t i o u sD i s e a s e s ,B e i j i n gD i t a nH o s p i t a l,B e i j i n g 1 0 0 0 1 1,C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e T oc l o n e an e wh u m a ng e n e 5t r a n s - a c t
5、i v a t e db yp r e - S 1p r o t e i no fh e p a t i t i sBv i r u s(H B V) ,P S 1 T P 5,a n de x - p l o r e i t s s t r u c t u r e a n d f u n c t i o nb yb i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s . M e t h o d s P S 1 T P 5w a s a m p l i f i e db y r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n - p
6、o l y m e r a s e c h a i n r e a c - t i o n(R T - P C R)t e c h n i q u eb yu s i n gH e p G 2c D N Aa s t e m p l a t ea n d i n s e r t e d i n t op G E M - Tv e c t o rb yT Ac l o n i n g . R e c o m b i n a n t e u k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o rp c D N A TM3 . 1 /m y c - H i sA
7、 - P S 1 T P 5h a db e e n c o n s t r u c t e db y s u b c l o n i n g,f o l l o w e db y r e s t r i c t i o ne n z y m e d i g e s t i o na n a l y s i s a n ds e q u e n c i n g . B i o i n f o r m a t i cm e t h o d sw e r eu s e d t oa n a l y z e i t sp o s s i b l ep h y s i c a l a n dc h e
8、 m i c a l c h a r a c t e r s,s t r u c t u r e,a n d f u n c t i o n . R e s u l t s P S 1 T P 5w a s s u c c e s s f u l l y a m p l i f i e d a n d c l o n e d i n t op G E M - Ta n dp c D N A TM3 . 1 /m y c - H i sAv e c t o r b yR T - P C Rf r o mH e p G 2 c D N A. T h e n e wg e n eh a db e e
9、 nc o n f i r m e db ys e q u e n c i n ga f t e rP C Ri d e n t i f i c a t i o na n dr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o na n dn a m e da sP S 1 T P 5b e c a u s eo f i t s t r a n s - a c t i v e f u n c t i o n . T h e s e q u e n c e f o r t h eP S 1 T P 5g e n eh a db e e nd e p o
10、s i t e d i n t oG e n B a n k,t h e a c c e s s i o nn u m b e rw a sA Y 4 2 7 9 5 3 . B i o i n - f o r m a t i c s a n a l y s i s s h o w e d t h a t i t sO R Fw a s 4 3 8 b pa n dt r a n s l a t e dap r o t e i no f 1 4 5a a . C o n c l u s i o n An e wg e n e - P S 1 T P 5h a sb e e nr e c o g
11、 - n i z e d,a n d i t s r e c o m b i n a n t e u k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o r(p c D N A TM3 . 1 /m y c - H i sA - P S 1 T P 5)h a sb e e nc o n s t r u c t e d . T h e s e r e s u l t sw i l l c e r - t a i n l yb r i n gs o m en e wc l u e s f o r t h e s t u d yo f t h eb i o l
12、 o g i c a l f u n c t i o no fn e wg e n e a n dp a t h o g e n e s i so f c h r o n i ch e p a t i t i sB . K e yw o r d s h e p a t i t i sBv i r u s;p r e - S 1p r o t e i n;t r a n s - a c t i v a t i o n;g e n e s,P S 1 T P 5;c l o n i n g 乙型肝炎病毒(H B V) 基因组具有4个开放读码框 (O R F), 通过不同的起始密码子(A T G)编
13、码至少7个 蛋白, 包括3个表面抗原: 包膜蛋白前- S l、 前- S 2、 S、 核 心抗原(H B c A g) 、 e抗原(H B e A g) 、 病毒多聚酶(P) 、X 蛋白(H B x A g) 1 4。包膜蛋白的作用主要是允许病毒 核壳体进出宿主肝细胞而不引起细胞裂解。前- S 1具 有双重作用, 它既是在病毒包膜装配过程中与核心颗 粒结合的配体, 也是在病毒感染过程中与宿主细胞受 体相互作用的底物。纪冬等 5利用抑制性消减杂交 ( S S H) 技术, 发现了H B V前- S 1蛋白反式激活蛋白5 基因( P S 1 T P 5) , 为探讨其生物学功能及其作用, 我们应
14、用P C R技术对其进行扩增与克隆, 构建其真核表达载 体, 对其生物学功能进行预测分析, 为今后更加广泛深 入地研究H B V前- S l蛋白作用提供新的方向。 1 材料与方法 1 . 1 实验材料和试剂 肝母细胞瘤细胞系 H e p G 2及 大肠杆菌D H 5 为本室保存, T a q 酶( 鼎国生物) ,T 4 D N A连接酶、p G E M - T,I P T G及X - - g a l购于P r o m e g a 公司, 玻璃奶回收试剂盒购自博大泰克公司, 引物合成 及D N A序列测定均由I n v i t r o g e n公司完成, E c o RI、B g l 、B a
15、 mHI购自T a k a r a生物公司,M a r k e rD L 1 5 0 0 0和 D L 2 0 0 0分别购自T a k a r a生物公司。p c D N A TM3 . 1 / m y c - H i sA由北京大学人民医院肝病研究所魏来教授 惠赠。 1 . 2 P S 1 T P 5基因序列的确定及聚合酶链反应(P C R) 扩增 根据P S 1 T P 5的全长编码基因 5, 设计2条引 物, 正义链引物5 - C G G A A T T CA T G G G C T T G A A G A - 作者简介: 张健康, 博士生, 副主任医师。主要从事慢性肝病的临床与基 础
16、研究。E - m a i l: y e s z j k 1 2 6 . c o m 作者单位:1 0 0 0 1 1 北京 北京地坛医院传染病研究所( 张健康、 郭江、 成军、 王丹琼、 伦永志、 蓝贤勇、 洪源、 毛羽) ; 山西医科大学第一医院消化 内科( 张健康) , 感染病科( 赵龙凤) 通信作者: 成军,E - m a i l:c j g e n e t h e r a p y . c o m . c n 基金项目: 国家自然科学基金资助项目(3 0 3 7 1 2 8 8) ; 国家重点基础研究 项目(9 7 3项目) (2 0 0 4 C B 5 1 8 9 0 8) ; 北京市
17、自然科学基金项目(5 0 4 2 0 2 4) 954 解放军医学杂志2 0 0 6年5月 第3 1卷 第5期M e dJC h i nP L AV o l 3 1N o5M a y2 0 0 6 G C C A C - 3 , 引入E c o RI酶切位点( 下划线序列) , 反义 链引物5 - C G A G A T C T AG T G A A G A T A T G C A G A G G- 3 , 引入B g l酶切位点( 下划线序列) 。提取H e p G 2细 胞的总R N A, 进行反转录, 以反转录产物c D N A为模 板进行P C R,P C R参数如下: 9 5 6 m
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