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1、田 2 0 0 8 ,V 0 1 2 5N o 6 亿亏与生物互程 C h e m i s t r y & B i o e n g i n e e r i r 噶l 久效磷人工抗原的制备、鉴定与免疫效价的测定 夏莹。李中振,杨迪,杨旭,丁书茂。袁均林 ( 华中师范大学生命科学学院环境科学实验室,湖北武汉4 3 0 0 7 9 ) 摘要:以戊二醛为交联剂制备了久效磷( M c p ) 人工抗原( M c p - O V A ) 和包被抗原( M c p - B S A ) ,采用紫外吸收光谱 和S D S - P A G E 对人工抗原进行了鉴定。取人工抗原免疫B A L B c 小鼠。并采用E
2、 L I S A 法对小鼠抗血清效价进行了检 测。结果表明,人工抗原中M c p 与O V A 的偶联比为2 3 3 :l ,M c p - O V A 的最适包被浓度为1 5p g m L ,3 次免疫后 小鼠的抗血清效价均达到1 :2 1 0 j 以上。 关键词:久效磷;人工抗原;抗血清 中图分类号:T Q4 5 0 2Q5 0 3文献标识码:A文章编号:1 6 7 2 5 4 2 5 ( 2 0 0 8 ) 0 6 0 0 3 8 - - 0 3 随着社会经济的发展及人们生活水平的提高,食 品安全问题已引起全社会的广泛关注,其中农药残留 的检测尤为重要 1 2 。久效磷( M o n o
3、 c r o t o p h o s , M c p ) ,化学名为0 ,o 二甲基0 一( 1 一甲基一2 一甲基氨基 甲酰基) 乙烯基磷酸酯,商品名为A z o d r i n 或N u v a c r o n ,是一种高效内吸性、兼有强烈触杀和胃毒作用的 有机磷杀虫剂,大白鼠经皮L D 。为4 1 9 8m g k g , 急性经口L D 。为1 1 2m g k g 3 3 。由于其杀虫谱 广、药效高,使用量逐年增加。酶联免疫吸附分析技术 ( E L I S A ) 将化学合成、生物技术与理化测试手段有机 结合起来,具有特异性强、灵敏度高( 检测限可达1 0 哪 1 0 1 2 级)
4、、方便快捷、分析容量大、分析费用低、仪器 化程度要求不高等特点,在对复杂样品中超微量农药 残留分析和现场快速检测方面,具有广阔的应用前景 和开发潜力 4 。近年来E I ,I S A 检测技术在农药残留 分析方面的研究日益增多,但关于久效磷的E L I S A 检 测方法国内外还未见报道。 作者在此以戊二醛为交联剂制备了久效磷人工抗 原( M c p - O V A ) 和包被抗原( M c p - B S A ) ,取人工抗原 免疫小鼠,并用间接E L I S A 法检测了抗血清效价。 1 实验 1 1 材料、试剂与仪器 雌性B A L B c 小鼠,体重1 8 2 2g ,湖北省疾病 预防
5、控制中心实验动物饲养中心。 久效磷( 纯度为9 9 0 ) ,D r E h r e n s t o H e r 公司; H R P 标记羊抗鼠I g G ,J a c k s o n ,中山公司分装;B S A , R o c h e 分装;卵清蛋白( 0 V A ) 、福氏完全佐剂和福氏 不完全佐剂,S i g m a 公司;戊二醛溶液( 5 0 ) 。 包被缓冲溶液( 0 8 5m o l 一L 一、p H 值9 6 的碳 酸缓冲溶液) :N a :C 0 31 5 9g 、N a H C 0 32 9 3g ,加蒸 馏水至1 0 0 0m L 。 封闭液:1 明胶( 用包被缓冲溶液配制
6、) 。 洗涤缓冲溶液( P B S T ) :含0 0 5 ( 体积比) T w e e n 一2 0 的0 0 1m o l L _ 1P H 值7 4 的P B S 。 抗体稀释溶液:含0 0 5 ( 体积比) T w e e n 一2 0 、0 1 ( 体积比) 明胶的0 0 1m o l L _ 1p H 值7 4 的P B S 。 U P 2 0 0 S 型超声波粉碎机,H i e l s c h e r ;“ - 3 1 0 0 型 U V V i s i b l e 分光光度计,S c i n c o ;A V A T A R3 6 0 型 F T I R 红外光谱仪,N i c
7、 o l e t ;真空干燥机,L a b c o n c o ; 5 4 1 0 型C O :恒温培养箱,N a p c o ;p Q u a n t 连续波长酶 标仪,B i o - t e c k ;自动凝胶成像仪,E E C 。 1 2 方法 1 2 1 久效磷人工抗原和包被抗原的制备 以久效磷为原料,采用戊二醛法将久效磷与载体 卵清蛋白( O V A ) 交联制备人工抗原 ,合成路线见 图1 。 将4m L2m g m L _ 1 久效磷溶液与1 0 弘L 戊二 醛混合,避光搅拌2 0m i n ,加入4m L4m g m L 一1 O V A 溶液,继续避光搅拌反应2 4h 。反应
8、完毕,将反 应混合液装入透析袋中,于4 “ C 生理盐水透析3d ,即 得久效磷人工抗原。同法制备包被抗原,将载体蛋白 基金项目:国家科技部建设部科技支撑计划资助项目( 2 0 0 6 B A J 0 2 A 1 0 ) ,国家科技部卫生部科技支撑计划资助项目( 2 0 0 6 B A I l 9 8 0 5 ) 收稿日期:2 0 0 8 一0 2 2 8 作者简介:夏莹( 1 9 8 4 一) ,女,湖北武汉人。硕士研究生,研究方向:生物化学及分子生物学;通讯联系人:袁均林,副教授。E m a i l : y u a n j l m a i l c c n u e d u c n 。 夏莹等
9、:久效磷人工抗原的制备、鉴定与免疫效价的测定2008年囊6啊图 嘲一。茸星c n ; C H 。 竺竺兰! 竺 P m l r e i n 器;皿。r c _ ¥F 一。 C H 3C H , 图1 人工抗原的合成路线 F i g 1 T h es y n t h e t i cr o u t eo fa r t i f i c i a la n t i g e n 0 V A 换成B S A 。 1 2 2 抗原的鉴定 1 2 2 1 偶联比的计算 由于O V A 中不含磷,因此可用微量定磷法 6 测 定人工抗原中久效磷分子的浓度,以标准品浓度为横 坐标、0 1 9 。为纵坐标绘制微量磷标准
10、曲线。抗原中载 体蛋白的浓度通过F o l i n 一酚法测定。偶联比( 每分子 载体蛋白上连接的久效磷的分子个数) 依下式计算。 偶联比= 糕器筹蒌撩嚣键篇瀑 1 2 2 2 紫外分光光度法分析 用生理盐水调零,配制1m g m L - 1 载体蛋白,分 别对载体蛋白、久效磷溶液、人工抗原、包被抗原进行 紫外吸收光谱扫描。 1 2 2 3S D S - P A G E 电泳分析 参照文献 7 ,对人工抗原和包被抗原进行S D S - P A G E 电泳分析。 1 2 3 人工抗原免疫小鼠与抗血清效价检测 取人工抗原2 5 0 肚L ,加等体积佐剂制成乳化剂免 疫雌性B A L B c 小鼠
11、。第5 次免疫后7 1 0d 尾部采 血,收集血清,参照文献 8 用间接E L I S A 法检测抗血 清效价,并确定最适包被浓度和抗血清稀释倍数 9 。 2 结果与讨论 2 1 抗原偶联比的计算 2 1 1 蛋白质浓度测定 蛋白质标准曲线见图2 。 蛋白质浓度t t g m L 一1 图2 蛋白质标准曲线 F i g 2 S t a n d a r dc u r v eo fp r o t e i n 通过测定O D 。z ,按照蛋白质标准曲线计算久效 磷一O V A 和久效磷一B S A 的蛋白质浓度分别为6 2 5 肛g m L 、3 9 0 肛g m L 。 2 1 2 磷浓度测定 微
12、量磷标准曲线见图3 。 图3 微量磷标准曲线 F i g 3S t a n d a r dc u r v eo ft r a c eP 通过测定0 D 。,按照微量磷标准曲线计算久效 磷一0 V A 和久效磷一B S A 的微量磷浓度分别为9 4 弘g m L 、3 4 4 肚g m L - 。O V A 、B S A 的分子量分别 为4 3k D 和6 5k D ,计算得到久效磷一0 V A 中久效磷 与O V A 的偶联比为2 3 3 :1 ,久效磷一B S A 中久效磷 与B S A 的偶联比为1 3 7 :1 。 2 2 紫外分光光度法分析 M c p 、O V A 、M c p -
13、O V A 的紫外扫描图谱见图4 。 W a v e l e n g t h r i m 图4M c p 、O V A 和M c p - O V A 紫外扫描图谱 F i g 4 U l t r a v i o l e ts p e c t r ao fM c p 。O V Aa n dM c p - O V A 由图4 可见,0 V A 在2 7 3 2a m 处有强吸收;M c p 在紫外区无明显吸收,只在2 2 8 6n m 处有一肩峰;而 M c p - O V A 在2 5 0 3n m 处有明显出峰,3 条紫外扫描 曲线峰值有明显的改变。这是因为透析后不存在游离 的M o p ,所
14、以这种吸收特征是M o p - O V A 偶合物引起 的,说明M c p - O V A 相对于M c p 和O V A 在化学结构 上发生了变化。证明载体蛋白成功地与M e p 发生了 偶联。 M c p 、B S A 和M c p - B S A 的紫外扫描图谱见图5 。 由图5 可见,M c p - B S A 在2 4 8 6n m 处有明显出。 4 3 2 l O 穹薏u写qjo暑 囫 夏莹等:久效磷人工抗原的制备、鉴定与免疫效价的测定2 0 姻年囊6 朋 图5M c p 、l I S A 和M c p - B S A 紫外扫描图谱 F i g 5 U l t r a v i o
15、l e ts p e c t r ao fM c p B S Aa n dM c p - B S A 峰,同理也可推断出M c p - B S A 偶联成功。 2 3S D S - P A G E 电泳分析 人工抗原和包被抗原的S D S - P A G E 电泳分析结 果见图6 。 1 低分子量蛋白M a r k e r2 O V A 3 M c p - O V A4 B S A5 M c p - B S A 图6S D S - P A G E 电泳结果 F i g 6 T h er e s u l t so fS D S - P A G E 由图6 可见,人工抗原和包被抗原的电泳条带与 载
16、体蛋白不同,与相应载体蛋白相比均出现滞后现象, 证明半抗原与O V A 和B S A 偶联成功。 2 4 最适包被浓度和抗血清效价测定 抗血清间接E L I S A 曲线见图7 。 图7 抗血滑间接E L I S A 曲线 F i g 7 I n d i r e c tE L I S Ac l n 伸eo fa n t i s e r u m 由图7 可见,当包被浓度为3 0 肚g - m L 、抗血 清稀释倍数为1 28 0 0 倍时,0 9 t 。2 = 1 0 1 2 ;当包被浓度 为1 5p g m L ,抗血清稀释倍数为6 4 0 0 倍时, O D 4 9 2 1 0 2 2 ;当
17、包被浓度为0 5 z g m L 一、抗血清 稀释倍数为1 6 0 0 倍时,0 D 。2 = 1 1 2 5 。 对于竞争性E L I S A 筛选条件的选择,一般选取 O D 值在1 0 左右的条件较合适 1 引。低浓度包被抗原 有利于间接竞争性E L I S A 的目标分析物竞争,但血清 消耗量较大,相对误差也会增加。综合考虑,后续的效 价检测与间接竞争E L I S A 选取1 5 l g m L _ 1 为M c p - O V A 最适包被浓度,抗血清稀释倍数为6 4 0 0 倍。 抗血清的效价如表l 所示。 表1 T a b 1 抗血清的效价 T i t e r so fa n
18、t i s e r u m 稀释倍数5 1 2 0 01 0 2 4 0 0 2 0 4 8 0 04 0 9 6 0 0 8 1 9 2 0 01 6 3 8 4 0 0 阴性对照 18 小鼠0 4 1 00 3 1 90 2 1 00 1 9 4 0 1 8 4 0 1 2 10 0 8 1 2 小鼠0 4 1 30 3 8 0 0 2 5 90 1 8 00 1 4 00 1 1 80 0 8 6 3 8 小鼠0 3 9 30 3 4 60 2 4 10 1 7 20 1 3 10 1 1 30 0 8 0 4 # 小鼠0 2 4 0 0 2 3 10 1 7 40 1 2 60 1 1
19、 30 1 0 30 0 8 3 5 “小鼠0 2 4 70 2 2 10 1 7 80 1 6 00 1 4 40 1 1 70 0 7 9 由表1 可见,3 次免疫后经E L I S A 测定,5 只小鼠 抗血清效价均达到了1 :2 1 0 5 以上,说明久效磷人 工抗原偶联成功,免疫效果明显,获得了高效价的抗血 清,可以满足后续久效磷单克隆抗体制备的需要。 3结论 以久效磷为原料、采用戊二醛法与0 V A 和B S A 偶联制备久效磷的人工抗原和包被抗原,方法简单易 行。通过对制得的抗原进行S D 孓P A G E 电泳分析及 紫外吸收光谱扫描,确定合成的抗原结构符合预先的 设计。取人工
20、抗原免疫小鼠,采用间接E L I S A 法检测 抗血清效价,确定得到了高效价的抗血清,说明人工抗 原成功地诱导机体产生了免疫应答,为久效磷单克隆 抗体制备及其免疫分析检测提供了基础。 参考文献: E l i 杨军我国食品中有机磷农药残留现状及干预措施E J l 中国公共 卫生杂志,2 0 0 0 ,1 6 ( 8 ) :7 5 5 7 6 6 C 2 3 赵肃清,孙远明,乐学义,等农药人工抗原合成的研究进展E J l 农药。2 0 0 2 ,4 1 ( 3 ) :9 - 1 1 3 万有葵,文保元,王庆林农药毒性博览E M 济南:山东科学技术 出版社,1 9 8 6 :3 - 4 4 J u
21、 n gF ,G e e SJ ,H a r r i s o nRO ,e ta 1 U s eo fi m m u n o c h e m i c a lt e c h n i q u e sf o rt h ea n a l y s i so fp e s t i c i d e s J P e s t i cS e i ,1 9 8 9 2 6 ( 3 ) : 3 0 3 - 3 1 7 s J 贾明宏,钱传范,韩丽君,等甲基对硫磷人工抗原的合成与鉴定 E J l 农药学学报,2 0 0 3 ,5 ( 2 ) :2 2 3 2 6 3M o r r i s o nWR Af a s t
22、,s i m p l ea n dr e l i a b l em e t h o df o rt h em i c r o d e t e r m i n a t i o no fp h o s p h o r u si nb i o l o g i c a lm a t e r i a l s J A n a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y ,1 9 6 4 ,( 7 ) :2 1 8 - 2 2 4 ( 下转第4 5 页) 梅妹等:丁香酚对金黄色葡萄球菌全基因组转录水平的影响研究2 0 0 8 年囊6 期 2 1 2 2 E 2 3 固 p r
23、 i s t i n d a l f o p r i s t i na t t e n u a t e sv i r u l e n c eo fS t a p h y l o c o c c u sa u 一 2 0 0 3 ,2 9 9 ( 5 6 0 8 ) :9 0 6 9 0 9 r e u s J JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r ,2 0 0 6 ,5 8 ( 3 ) :5 6 4 5 7 4 2 4 A l e x a n d e rOG ,R i c h a r dAH o l l e y M e c h a n i s m so f
24、b a c t e r i c i d a l L u o n gTT 。D u n m a nPM 。M u r p h yE ,e ta 1 T r a n s c r i p t i o np r o ( i - a c t i o no fc i n n a m a l d e h y d ea g a i n s tL i s t e r i am o n o c y t o g e n e sa n do f l i n go ft h em g r Ar e g u l o ni nS t a p h y l o c o c c u sa u r e u s U 3 JB a c
25、 t e r i e u g e n o la g a i n s tL m o n o c y t o g e n e sa n dL a c t o b a c i l l u ss a k e i J o l 。2 0 0 6 ,1 8 8 ( 5 ) :1 8 9 9 1 9 1 0 A p p lE n v i r o nM i c r o b i 0 1 2 0 0 4 。7 0 ( 1 0 ) :5 7 5 0 5 7 5 5 P a l l e nMJ 。L a mAC ,A n t o n i oM ,e ta 1 A ne m b a r r a s s m e n to
26、f z 5 3B e e n k e nKE ,D u n m a nPM ,M c A l e e s eF ,e ta 1 G l o b a lg e n ee x s o r t a s e 一Ar i c h n e s so fs u b s t r a t e s J T r e n d sM i c r o b i o l ,2 0 0 1 ,p r e s s i o n i nS t a p h y l o c o c c u s a u r e u sb i o f i l m s J JB a c t e r i o l ,2 0 0 4 , 9 ( 3 ) :9 7
27、1 0 2 1 8 6 ( 1 4 ) :4 6 6 5 4 6 8 4 M a z m a n i a nSK ,S k a a rEP G a s p a rAH ,e ta 1 P a s s a g eo fh e i n e - 2 6 M o b l e yHL ,I s l a n dMD ,H a u s i n g e rRP M o l e c u l a rb i o l o g yo f i r o na c r o s st h ee n v e l o p eo fS t a p h y l o c o c c u sa u r e u s J S c i e n
28、c e , m i c r o b i a lu r e a s e s E J M i c r o b i o lR e v ,1 9 9 5 ,5 9 ( 3 ) :4 5 1 4 5 5 S t u d yo nG l o b a lT r a n s c r i p t i o n a IP r o f i l i n go f S t ap h y l o c o c c u sA u r e u sT 。r e a t e dw i t hE u g e n o l M E IM e i l ,X I A N GH u a l ,D E N GX u - m i n 9 1 ,Y
29、UL u l ,Z H A N GL i a n g z ”,W A N GD a - c h e n 9 1 ( 1 C o l l e g eo fA n i m a lS c i e n c ea n dV e t e r i n a r yM e d i c i n e ,J i l i nU n i v e r s i t y ,C h a n g c h u n1 3 0 0 6 2 ,C h i n a ; 2 N a t i o n a lE n g i n e e r i n gR e s e a r c hC e n t e rf o rB e i j i n gB i o
30、 c h i pT e c h n o l o g y ,B e i j i n g1 0 2 2 0 6 ,C h i n a ; 3 C a p i t a lB i oC o r p o r a t i o n ,B e i j i n g1 0 2 2 0 6 ,C h i n a ) A b s t r a c t :T oi n v e s t i g a t et h ea n t i m i c r o b i a lm e c h a n i s mo fe u g e n o la g a i n s tS a u r e u s ,g l o b a lt r a n s
31、 c r i p t i o n a l p r o f i l i n go fS a u r e u si nr e s p o n s e t o s u b i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n so fe u g e n o lw e r ea n a l y z e d S a u r e u s A T C C 2 5 9 2 3w a st r e a t e dw i t h2 5 0P g m L e u g e n o lf o r4 5m i n ,C u s t o m l m a d eA f f y m e t
32、r i xG e n e C h i p s T Mw e r e u s e dt od e t e r m i n et h eg l o b a lt r a n s c r i p t i o n a lr e s p o n s eo fS a u r e u sA T C C 2 5 9 2 3t r i g g e r e db ye u g e n 0 1 A l t o g e t h e r 3 3 8g e n e sw e r ei d e n t i f i e dt ob eu p r e g u l a t e da n d4 4 0g e n e sw e r
33、ed o w n r e g u l a t e du p o ne x p o s u r et oe u g e n 0 1 O f t h e s e ,1 0 0t r a n s p o r t e rg e n e s ,4 5t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t o rg e n e si n v o l v e di np r o t e i ns y n t h e s i sa n d3 2v i r u l e n c e g e n e sw e r ed i f f e r e n t i a l l yr e g u l a
34、t e db ye u g e n 0 1 E u g e n o lr e p r e s s e dt h es o r t a s e n c o d i n gg e n eS A 0 9 8 2 ( s r t B ) a n d I s dg e n e so nc e l lw a l l G e n e C h i pa n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ea n t i m i c r o b i a lm e c h a n i s mo fe u g e n o la g a i n s tS a u r e u
35、 sa c h i e v e dt h r o u g ha f f e c t i n gd i f f e r e n tp a t h w a yg e n e ss i m u l t a n e o u s l y ,e s p e c i a l l yg e n e si n v o l v e di nt r a n s p o r t a t i o n ,i n f e c t i o np r o c e s s e sa n di n f o r m a t i o np a t h w a y s K e y w o r d s :S a u r e u s ;e
36、u g e n o l ;G e n e C h i p ;t r a n s c r i p t i o n a lp r o f i l i n g ( 上接第4 0 页) 7 刘成梅,黄丽,罗舜菁,等氨苄青霉素人工抗原的制备及鉴定 口 食品科学,2 0 0 7 。2 8 ( 9 ) :3 8 4 3 8 8 8 王庭华,李官成抗体理论与技术E M 北京:科学出版社。2 0 0 5 : 1 2 2 1 3 8 9 3 K i mYJ ,C h oYA ,L e eHS ,e ta 1 I n v e s t i g a t i o no ft h ee f f e c to f h a p
37、 t e nh e t e r o l o g yo ni m m u n o a s s a ys e n s i t i v i t ya n dd e v e l o p m e n to f a f te n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a yf o rt h eo r g a n o p h o s p h o r u s i n s e c t i c i d ef e n t h i o nE J A n a l y t i c aC h i m i c aA c t a 。2 0 0 3 4 9 4 (
38、 卜2 ) : 2 9 - 4 0 1 0 3 雷红涛,肖治理,方坚生,等丁草胺人工抗原及抗体制备研究 J 3 食品科学,2 0 0 7 ,2 8 ( 1 0 ) :6 7 - 7 1 P r e p a r a t i o na n dI d e n t i f i c a t i o no fA r t i f i c i a lA n t i g e nf o rM o n o c r o t o p h o s a n dD e t e r m i n a t i o no fI m m u n eT i t e r s X 1 AY i n g ,L IZ h o n g - z h
39、 e n ,Y A N GD i ,Y A N GX u ,D I N GS h u - m a o ,Y U A NJ u n - l i n ( L a b o r a t o r yo fE n v i r o n m e n t a lS c i e n c e ,C o l l e g eo fL i f eS c i e n c e ,C e n t r a lC h i n a N o r m a lU n i v e r s i t y ,W u h a n4 3 0 0 7 9 ,C h i n a ) A b s t r a c t :M o n o c r o t o p
40、 h o s ( M c p ) w a sc o n j u g a t e dt oB S Aa n dO V Av i ag l u t a r a l d e h y d et om a k ea r t i f i c i a la n t i g e na n dc o a t i n ga n t i g e n w h i c hw e r ei d e n t i f i e db yU V s p e c t r o m e t r ya n dS D S - P A G E B A L B cm i c ei m m u n i z e d b va r t i f i
41、c i a la n t i g e nw e r ei d e n t i f i e db yE L I S A T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n j u g a t e dr a t i oo fM c p t oO V Ai n M c P O V Aw a s2 3 3 :1 ,t h eo p t i m u mc o a t i n gc o n c e n t r a t i o nf o rM c p - O V A w a s1 5t t g m L A n dt h et i t e r so f a n t i s e r u mr e a c h e da b o v e1 :2X1 0 5w h e nt h em i c ew e r ei m m u n i z e df o rt h r e et i m e s K e y w o r d s :m o n o c r o t o p h o s ;a r t i f i c i a la n t i g e n ;a n t i s e r u m
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