丹参对大鼠肝星状细胞转化生长因子β1与Ⅰ型胶原MRNA表达的影响.pdf
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1、第 1 2 卷第 1 3 期 2 (N ) =年71 1 中国现代医学杂志 C h in a 7 o u ma l o f Mo d e Me d i c in e V , L 1 2 2 撒 一- 一 一一一= 二 竺 二 一一-= 二= 泛 一今一, 一一一 。 论著 丹参对大鼠肝星状细胞转化生长因子R I 与 I型胶原 mR N A表达的影响 福建医科大学附属第一医院普外科( 3 5 0 0 0 4 ) 蔡方刚 林永望翁山耕石铮刘景丰 目 的 探讨丹参杭扦纤维化的可能机制。方法: 链蛋白晦、 胶原醉离 体灌注大鼠肝胜, N y c o d e n z 密度祥度 离心分离肝星状细胞( H
2、S C ) 体外培养。不同浓度的丹参处理. 用R r - P C R法半定圣检咧H S C的转化生长因 子P ( I G F 有抑制作用 关被词 分类号 p , ) n i R N A与I 型胶原n i R N A的表达。结果: 开参对H S C , 的T G F 一 两与I 型胶原 。结论: 丹参杭肝纤维化作用可能与T G F - s和I 型胶原. R N A的表达下 调有关 丹参肝星:!k f ia 胞T G F 一 P t 胶原 R3 3 2q .R NA的表达 E F F E C T S OF S AL VI A MI L T I OR RHI Z A ON T HE E XP RE
3、S S I ON S OF T R A N S F O R MI N G G R O WT H F A C T O R 0 1 A N D T Y P E I P R OC OL L A GE N mR NA I N RA T HE P A T I C S T E L L A T E C E L L S C a i F a n g g a n g, L i n Y o n g k u n , We n g S h a n g e n g, e t a ( . D e p a r t m e n t o f G e n e r a l S u r g e r y , t h e F i r s
4、t A f f i l i a t e d H o s p i t a l , F u j i a n Me d i c a l Un i v e r s i t y , F u z h o u 3 5 0 0 0 4 , A b s t r a c t O b j e c t i v e : T o in v e s t ig a t e t h e p o s s i b le m e c h a n is m o f a n t if ib ro t ic a c t i o n o f S a l v ia m i lt io r r h iz a a t m o l e c u l
5、a r l e v e l . Me t h o d s : R a t h e p a t i c s t e l l a t e c e l l w a s s e p a r a t e d f rom r a t l i v e r b y p r o n a s e E a n d c o l l a g e ms e p e r f u s i o n a n d d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n w i t h N y c o d e n z . V a r i o u s c o n c e n
6、t r a t i o n s o f S a l v i a m i l t i o r r h iz a w e re a d d e d a n d i n - c u b a re d . T h e m R N A e x p r e s s io n s o f t r a n s f o r m in g g r o w t h f a c t o r (3 , ( T G F 一 3 ) a n d t y p ep ro c o l la g e n w e r e a n a ly z e d b y R I 一 P C R . R e s u lt s : S a lv
7、i a m il t io r r h iz a c o u ld i n h i b i t t h e e x p r es s io ns o f l G F 一 R , a n d t y p e I p r o c o lla g e n m R N A C o n c l m i o n : T h e a n t i f i b ro t i c a c t i o n o f S a l v i a m i l t io r r h i z a m a y b e r e l a t e d t o t h e d o w n 一 r e g u l a t i o n o f
8、 T G F 一 P , a n d t y p e I p r o c o l l a g e n r n R N A K e y w o r d s : S a l v ia Mi l t i o r r l u m; H e p a t i c S t e l l a t e C e l l s ; T G F 一 P t ; C o l l a g e n 近年来, 动物实验与临床均表明丹参可用于治 疗肝硬化, 并能取得较好的疗效。我们通过观察丹 参对体外培养的大鼠肝星状细胞( H S C ) 转化生长因 子P t ( t r a n s f o r m i n g g r o w t
9、 h f a c t o r p t , T G F 一 P t ) 与I 型胶原m R N A的表达的影响, 来探讨丹参治疗肝纤 维化的可能机理。 I 材料与方法 t _ I 材料与试剂 雄性 S D大鼠, 购 自上海普 尔 一必凯实验动物 1 现为华中科找大学同济tx学院叶启发教授在读博士生 有限公司。W型胶原酶、 N y c o d e n : 购自S i g m a 公 司。链蛋白酶 E , D M E M 细胞培养粉剂购 自 G I B C O R B I 公司。胎牛血清购自H y c lo n e 公司。鼠 抗人结蛋白( D e s m i n ) 单克隆抗体购自D A K O公司
10、 R N A抽提试剂盒( T R I Z O L ) 购自上海生工生物工 程公司, 逆转录试剂购自美国G I B C L B R L公司, 丹 参注射液购自正大青春宝药业有限公司。引物序列 参 考文献I 一 刘 , 由上海生工生物工程公司合成提 供。 1 . 2 原代大鼠肝星状细胞的分离培养与鉴定 参考翁山耕等f a l 方法, 分离原代大鼠肝星状细 胞。用常规台盼蓝排斥法鉴定细胞活率。选择激发 1 7 万方数据 中国现代医学杂志第 1 2卷 波长为3 2 8 n r n , 在荧光显微镜下观察并计数刚分离 出来的细胞中能自发出蓝绿色荧光的细胞数, 结合 结蛋白链 S P免疫组织细胞化学法鉴定
11、分离纯度。 细胞长满单层后, 经胰蛋白酶消化并传一代培养。 13 R 丁一P C R实验方法 初次传代的肝星状细胞, 接种于培养孔板内预 培养7 2 h 后, 按每孔不同浓度的丹参药液分为4 组, 药物终浓度分别为 0 ( 对照组, 加磷酸盐缓冲液 P B S ) , 0 0 0 p g / m l 组, 1 2 0 0 p g / m l 组 2 4 0 0 1, g / m l 组 再培养4 8 h , 分别进行检测。 1 . 3 . 1 R 丁一P C R用 T r i z o l 试剂盒, 按说明书介 绍的方法, 提取 R N A逆转录合成 c D N A, 取 c l ) N A 模
12、板5 p l , 1 0 x b u f f e r 5 . O p l , 2 5 m m o l / L M g C l_ 4 . O p l , 特异上下游引物各2 0 0 p m o l , T a g D N A聚合酶2 . 0 u , 去离子水补至5 0 一 0 川, 加石蜡油5 0 闪封盖后进行扩 增。P C R循环条件为: 9 4 C 3 m i r : 预变性后, 按9 4 r - 4 5 s -5 5 C 4 5 s -7 2 *C 4 5 s 循环, 反复3 5 次, 最终延仲 7 2 *C 5 m i n , 4 保存。 1 . 3 . 2 P C R产物凝胶电泳及观察
13、取 P C R产物 1 O p l 用2 . 0 % 琼脂糖凝胶( S i g m a 公司) ( 含5 p g / m l 澳化乙咤) , S V / c m进行电泳, 同时以1 0 0 b p L a d d e r ( G I H C O B R L公司) 为 D N A m a r k e r s , 以出现 2 9 8 , 2 5 4 和2 3 4 b p 分 别表示为T G F 一 p : , . , ( I ) 前 胶原, R 一 a c t i n m R N A阳 性结果, 紫外线灯下观察结果并置 B i 。 一 R a d U V P 1 0 0 0 型凝胶成像分析系统(
14、基因公 司) 上分析, 以曲线下峰面积作为P C R产物含量, 用 丁 G F - (3 , m R N A , a c ( I ) 前胶原m R N A分别与p - a c t i n mR N A积分值之比, 表示该基因 mR N A表达 水平。 1 . 4 统计学处理 用S P S S 1 0 . 0 统计软件包进行资料的t 检验与 方差分析, P 0 . 0 5 有显著意义。 2 结果 21 细胞分离培养的结果 每只大鼠 肝脏的星 状细胞得率约为2 x 1 0 7 个, 台盼蓝染色细胞活率超过 9 5 。细胞鉴定依靠在 相差倒置显微镜下, 可见到刚分离出来的肝星状细 胞胞内富含有脂滴的
15、形态; 荧光显微镜下可见在 3 2 8 n m波长的激发光下发出极易碎灭的蓝绿色荧 光: 免疫组化结蛋白表达阳性等, 分离原代细胞纯度 在9 0 %以上。对照组与丹参组中细胞均生长良 好。 2 . 2 丹参对T G F 一 (3 1 m R N A表达的影响 表1 丹参对r G F 一 (3 , m R N A表达的影响临 = ) 丹参浓度( 1 . 8 / m 1 ) U 6 0 0 1 2 0 0 ?4 0 0 T G F 一 p , m R N A积分光密1I f k / R 一 淞L m 积分光密度值 1 . 2 7 6 士0 . 0 4 5 卜0 9 8士 0 . 0 8 9 0 .
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- 关 键 词:
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