三种糖类对新生隐球菌荚膜相关基因CAP10启动活性的影响.pdf
《三种糖类对新生隐球菌荚膜相关基因CAP10启动活性的影响.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《三种糖类对新生隐球菌荚膜相关基因CAP10启动活性的影响.pdf(4页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、1 3 2 第 二 军 医 大 学 学 报 A c a dJS e c M i l M e d U n i v 2 0 0 6F e b ;2 7(2) 专题报道 三种糖类对新生隐球菌荚膜相关基因- 4 =1 V启动活性的影响 赵志宇,温 海*,陈孙孝( 第二军医大学长征医院皮肤性病科, 上海2 0 0 0 0 3) 摘要 目的:研究葡萄糖、 甘露糖、 半乳糖对新生隐球菌荚膜相关基因C A P1 0启动活性的影响。方法:用含C A P1 0编码 区上游5 侧翼序列(-9 5 10b p) 和报告基因的重组体转化酵母, 分别用不同浓度(1 0、2 0、4 0、6 0、8 0m g/m l) 的葡
2、萄糖、 甘露 糖、 半乳糖对其进行干预, 用E L I S A方法检测C A T表达值, 比较各组间C A T表达活性的不同。结果:不同浓度的葡萄糖和 甘露糖对C A T的表达强弱无明显的影响; 而不同浓度的半乳糖对C A T的表达强弱有明显的影响, 而且这种正向诱导作用在 实验所用的剂量范围内具有剂量依赖关系。结论:葡萄糖和甘露糖对C A P1 0启动活性无明显影响; 半乳糖对C A P1 0的启 动活性有明显的诱导作用, 推测C A P1 0基因可能与新生隐球菌中半乳糖的代谢有关。 关键词 新生隐球菌; 荚膜; 基因; 启动子; 葡萄糖; 甘露糖; 半乳糖 中图分类号 R3 7 9. 5
3、文献标识码 A 文章编号 0 2 5 8 - 8 7 9 X(2 0 0 6)0 2 - 0 1 3 2 - 0 4 E f f e c t so f3c a r b o h y d r a t e so n- 4 =1 Vp r o m o t e ra c t i v i t yo f- % ( ) * # # + , . “ # $ # % t h e t r a n s f e c - t a n t sw e r e t r e a t e dw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s(1 0,2 0,4 0,6 0,8
4、0m g/m l)o f g l u c o s e,m a n n o s ea n dg a l a c t o s e . C A Ta c t i v i t yw a s a s s e s s e db yE L I S A m e t h o da n dC A Ta c t i v i t i e so fd i f f e r e n tg r o u p sw e r ec o m p a r e d . R e s u l t s:D i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s e a n dm a n
5、 n o s eh a dn oo b v i o u s i n f l u e n c eo nC A Ta c t i v i t y;d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fg a l a c t o s eh a do b v i o u s i n f l u e n c eo nC A Ta c - t i v i t ya n dt h e i n f l u e n c ew a sp o s i t i v e l yd e p e n d e n tw i t h i t sd o s ew i t h i nt h
6、 ee x p e r i m e n t a l c o n c e n t r a t i o nr a n g e . C o n c l u s i o n:G l u c o s e a n dm a n n o s eh a v en oo b v i o u se f f e c to nt h ea c t i v i t yo fC A P1 0p r o m o t e r;g a l a c t o s eh a so b v i o u si n d u c t i v ee f f e c to na c t i v i t yo f C A P1 0p r o m
7、o t e r,s u g g e s t i n gt h a tC A P1 0g e n em i g h tb er e l a t e dw i t hg a l a c t o s em e t a b o l i s m. K E Y WO R D S C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s;c a p s u l e;g e n e;p r o m o t e r;g l u c o s e;m a n n o s e;g a l a c t o s e A c a dJS e cM i lM e dU n i v, 2 0 0
8、6,2 7(2) :1 3 2 - 1 3 5 基金项目 国家自然科学基金(3 0 2 7 0 0 8 0). S u p p o r t e db yN a t i o n a l N a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a(3 0 2 7 0 0 8 0). 作者简介 赵志宇, 博士, 主治医师. E - m a i l:z h a o z y 4 1 2y a h o o . c o m. c n *C o r r e s p o n d i n ga u t h o r . E - m a i l: w e n h
9、 a i 9 8s o h u. c o m 新生隐球菌是常见的致病真菌之一, 由于近年 来艾滋病的流行及临床上免疫抑制剂的大量应用, 新生隐球菌病的发病率呈明显的上升趋势 1,2。多 糖荚膜结构是新生隐球菌最主要的毒力因子之一, 作为一个天然的屏障, 可以帮助隐球菌逃避宿主吞 噬细胞的吞噬作用、 抑制炎症反应, 从而逃避宿主的 免疫攻击 3,4。它主要由甘露聚糖、 葡聚糖、 木糖、 半乳糖等组成。目前已知荚膜的合成与C A P6 0、 C A P5 9、C A P6 4、C A P1 0等基因有关。这4个基因 编码的荚膜蛋白是荚膜合成所必需的, 缺失任何一 个基因都会导致荚膜的生成缺陷, 从
10、而导致致病力 的下降 58。 本实验构建了含C A P1 0上游启动序列及报告 基因的重组质粒, 并转化酵母, 得到能表达报告基因 的转化子。以此为平台, 以不同浓度的半乳糖、 甘露 糖、 葡萄糖对转化子进行干预, 通过检测报告基因的 表达强弱来探讨3种糖类对C A P1 0基因启动活性 的影响。 1 材料和方法 1. 1 菌株和质粒 酿酒酵母UR A 3缺陷株S - 7 8 、 新生隐球菌B - 3 5 0 1由中国医学真菌保藏管理中心 隐球菌专业实验室保存; 大肠杆菌DH 5 购自P r o - m e g a公司; 质粒P c x j 1 8由复旦大学遗传所保存; P c a t - e
11、 n h a n c e rV e c t o r购自P r o m e g a公司。 1. 2 主要试剂 酵母基因组D NA 提取试剂盒购 自华舜试剂公司;P r o o f s t a r t高保真P C R试剂盒购 自Q i a g e n公司; 限制性内切酶及T 4D NA连接酶购 自N E B公司; 氯霉素乙酰基转移酶(C AT)E L I S A 检测试剂盒购自R o c h e公司;G l a s sB e a d s购自S i g - 第2期.赵志宇, 等.三种糖类对新生隐球菌荚膜相关基因C A P1 0启动活性的影响1 3 3 m a公司; 其余试剂为国产分析纯试剂, 常用试
12、剂配 制参照文献 9 。 1. 3 重组体P c x j c a t t 9 5 1的构建 1. 3. 1 含C AT报告基因重组体P c x j c a t的构建 根据P c a t - e n h a n c e r质粒说明书提供的C AT的全长 序列, 应用D NA分析软件和引物设计软件进行设 计, 在引物的两端分别加入限制性酶S m a和X b a 的 酶 切 位 点,引 物 序 列 如 下:5 t c c c c g g g a t g - g a g a a a a a a a t c a c t g g,3 c g a c t c t a g a t t a c g c c c
13、c。以P c a t - e n h a n c e r为模板, 用P r o o f s t a r t高保真P C R试剂盒 扩增各重组体目的片段, 扩增体系和扩增条件按操 作说明进行。 扩增产物经切胶小量柱回收后, 用限制性内切 酶S m a和X b a酶切目的片段产物及P c x j 1 8。 切胶回收酶切后的质粒和目的片段, 定量。酶切后 的目的片段和线性P c x j 1 8具有相同的黏末端, 经 T4连接酶连接。感受态细菌的制备和转化参见文 献 9 。经氨苄青霉素抗性筛选, 小量酶切初步鉴 定、 测序正确后, 大量扩增阳性克隆。所得重组体命 名为P c x j c a t。 1.
14、 3. 2 含终止子及C AT的重组体P c x j c a t t的构 建 根据G e n B a n k所提供的新生隐球菌T R P 1基 因的终止子序列(A c c e s s i o nM 7 4 9 1) , 应用D NA分 析软件和引物设计软件P r i m e rP r e m i e r5进行引物 设计, 引物的两端分别加入限制性酶X b a和P s t 的酶切位点, 引物序列如下:5 a t g g t a c c t t g t g a a g - g c c g t a a g g g g t t,3 g c a t c c t g c a g g c g a c a g
15、 a a g a g a a a t g - g t g a。 提取新生隐球菌B - 3 5 0 1基因组D NA( 参见酵 母基因组D NA提取试剂盒说明书) 。以新生隐球 菌B - 3 5 0 1基因组D NA为模板, 扩增体系和扩增条 件按操作说明进行。用限制性内切酶X b a和P s t 酶切目的片段产物及P c x j c a t, 目的片段和载体质 粒连接、 感受态细菌的制备和转化步骤同前。重组 体经小量酶切鉴定、 测序正确后, 大量扩增阳性克 隆。所得重组体命名为P c x j c a t t。 1. 3. 3 含C A P1 0基因上游序列及C AT、 终止子的 重组体P c
16、x j c a t t 9 5 1的构建 根据G e n B a n k所提供 的C A P1 0阅 读 框 上 游 的 核 苷 酸 序 列 (A c c e s s i o n A F 1 4 4 5 7 4) , 应用D NA分析软件和引物设计软件 P r i m e rP r e m i e r5进行引物设计, 在引物的两端分 别加入限制性酶S a c或S m a酶切位点。拟插入 的片段长度分别为9 5 1b p, 所设计引物序列为: 5 c g a g c t c c t t g a a a a c a c g a g t g a c g,3 a t g g t a c c t a a
17、 g g t c c a - c a a g t g c。模板为新生隐球菌基因组D NA, 扩增体 系和扩增条件按操作说明进行。用限制性内切酶 S a c或S m a酶切目的片段产物及P c x j c a t t, 目的 片段和载体质粒连接、 感受态细菌的制备和转化步 骤同前。重组体经小量酶切鉴定、 测序正确后, 大量 扩增阳性克隆。所得重组体命名为P c x j c a t t 9 5 1。 1. 4 重组体P c x j c a t t 9 5 1的C AT表达活性鉴定 1. 4. 1 酵 母 转 化 将 重 组 质 粒P c x j c a t t 9 5 1 及 P c x j c
18、a t t分别经化学转化法转化酵母S - 7 8, 转化方 法步骤如下: 从Y P D平板上挑取S - 7 8克隆, 在3m l Y P D培养基中3 0震荡过夜; 取上述菌液0. 5m l 转接到5 0m lY P D中, 3 0震荡培养5h,50 0 0r/ m i n离心,5m i n收获细胞; 用大约2 0m l水洗菌, 离 心, 弃 水; 上 述 沉 淀 中 加 入L i A c溶 液 (1 m o l/L L i A c,1 0T E,H2O=1,1,8)1m l悬浮, 即得 感受态细胞; 取鲑精D NA稀释成5m g/m l, 煮沸5 m i n, 快速在冰中冷却; 取感受态细胞
19、2 0 0l, 依次加 入P E G 3 9 0 0液体( 1m o l/LL i A c,1 0T E,5 0% P E G=1,1,8)1. 2m l, 变性载体D NA2 0l( 约 1 0 2g) , 质粒1l(0. 51g) ;3 0缓慢震荡培养 3 0m i n;4 2热休克1 5m i n, 离心;2 0 0lT E溶液洗 1次, 重新悬浮于2 0 0lT E溶液中, 均匀涂布Y S D 平板。3 0倒置培养24d。提取各转化子的基因 组D NA, 以此为模板, 用C AT基因的扩增引物为 引物, 进行P C R扩增, 产物送基因公司测序鉴定。 1. 4. 2 蛋白提取及定量 转
20、化子在Y S D液体培养 基中3 0震荡培养9 6h, 用显微计数法定量, 用 Y S D调整菌量为11 0 8/ m l, 离心进行蛋白提取。 用预冷的P B S洗3次后, 加入裂解缓冲液(C AT E L I S A试剂盒中提供)1m l, 加入玻璃珠剧烈震荡2 m i n, 室温下静止3 0m i n, 离心1 0m i n后, 紫外分光 光度计进行蛋白定量。 1. 4. 3 C AT活 性 测 定 及 数 据 处 理 按C AT E L I S A试剂盒说明进行。2 0 0l细胞裂解液加入 已包被抗体的9 6孔板, 反应结束后加入底物显色, 酶标仪4 0 5n m和4 9 2n m测定
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 糖类 新生 球菌 荚膜 相关 基因 CAP10 启动 活性 影响
链接地址:https://www.31doc.com/p-3698535.html