【SN商检标准大全】SNT 2010-2007 植原体脱除方法.pdf
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1、书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖犜 植原体脱除方法 犕 犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉犲 犾 犻 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狆 犺 狔 狋 狅 狆 犾 犪 狊 犿 犪 发布 实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 书书书 前 言 本标准的附录、 附录、 附录、 附录均为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和
2、国上海出入境检验检疫局负责起草, 中国检验检疫科学研究院参加起草。 本标准主要起草人: 杨翠云、 于翠、 魏梅生、 赵文军、 乔艳艳、 陶庭典。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 植原体脱除方法 范围 本标准规定了植物种苗、 鳞球茎和组培苗的植原体脱除及检测的基本原则和方法。 本标准适用于进出境植物种苗、
3、 鳞球茎和组培苗的植原体脱除和检测。 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 植原体 狆 犺 狔 狋 狅 狆 犾 犪 狊 犿 犪 寄生于植物韧皮部和介体昆虫体内的、 具有三层单位膜结构的无细胞壁的原核生物。一般引起植 物叶片的黄化和发育畸形等症状, 对四环素族类抗生素敏感, 而对青霉素不敏感。 外植体 犲 狓 狆 犾 犪 狀 狋 用于植物组织培养的材料称为外植体, 其主要形式有器官、 胚胎、 单细胞和原生质体等。 脱植原体苗 狆 犺 狔 狋 狅 狆 犾 犪 狊 犿 犪 犳 狉 犲 犲犿 犻 犮 狉 狅 狆 犾 犪 狀 狋 应用茎尖组织培养等技术获得再生的试管苗, 经检测确认不带该种植物的有害
4、植原体, 可认定为脱 植原体苗。 原理 植原体形态一般有球形、 椭圆形、 长杆形、 梭形、 带状形和多态不规则形, 大小为 , 其 结构较病毒复杂, 具有细胞结构, 但没有细胞壁, 被单位膜包裹, 单位膜由两层蛋白质膜和中间一层脂膜 组成, 厚度约为 。 在植物体内植原体主要分布在韧皮部, 根尖和芽尖的分生组织内植原体含量少或不含植原体。在 高温下可钝化植原体, 明显减弱或抑制植原体在植物体内的繁殖。植原体对四环素族类抗生素敏感, 而 对青霉素不敏感。 仪器设备、 用具及试剂 仪器设备 超净工作台、 光照培养箱、 干燥箱、 电子天平、 微波炉等。 用具 镊子、 剪刀、 酒精灯等。 主要试剂 除
5、另有规定外, 所有试剂均为分析纯。乙醇、 漂白粉、 升汞、 培养基试剂( 见附录) 。 植原体脱除方法 茎尖培养脱除植原体 培养材料的灭菌处理 将组织培养材料用流水冲洗干净, 在凹凸不平处以及鳞片缝隙处用软刷等将污物彻底清除干净, 最 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 后一次用蒸馏水冲洗, 再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干, 并用消毒刀片切成小块。在无菌条 件下先在 酒精中浸 , 再将材料移入漂白粉饱和溶液中浸
6、 或 升汞水 中消毒 , 最后用无菌水清洗次次, 用无菌纸吸干水分。 植原体脱除的茎尖处理和培养 在无菌的环境下, 用无菌刀、 剪、 镊等将已消毒的工具, 剥去芽的鳞片、 嫩枝的外皮和种皮胚乳等, 将 含有叶原基的茎尖组织切成 的小段即外植体。立即将切好的外植体接种到 培 养基(培养基制备方法见附录。培养不同的植物需要在 培养基制作过程中添加不同比例的 生长素和细胞分裂素, 值为 ) 上, 每瓶接种个 个, 接种后的瓶或管用无菌药棉或盖 封口, 培养皿用无菌胶带封口。将接种好的材料放在温度 、 光周期 光照、 黑暗、 光照 强度 的条件下的光照培养箱中进行培养。 组培苗的生长管理 在组培苗的生
7、长过程中及时进行植原体脱除效果评定, 评定方法见第章。剔除含有植原体的 幼苗。 茎尖培养结合热处理脱除植原体 将待处理的植物材料放入 的温箱内, 根据植物不同需要处理几十分钟, 甚至几十天。 根据不同种类的植物, 植原体脱除的热处理还可以选择 热水处理 或 热水处理 。 将热处理好的植物材料取出后进行消毒和茎尖培养, 方法同 。在组培苗的生长过程中及时检 测植原体脱除是否完全, 植原体脱除效果评定见第章, 剔除含有植原体的幼苗。 茎尖培养结合化学处理脱除植原体 茎尖培养结合化学处理的基本方法同 , 只需在 培养基中加入 四环 素。对四环素敏感的植物不可采用该方法。在组培苗的生长过程中及时检测植
8、原体脱除是否完全, 植 原体脱除效果评定见第章, 剔除含有植原体的幼苗。 植原体脱除效果评定 经脱除植原体的植株, 需进行 方法检测( 见附录) 。如果 检测结果为阴性, 即可判断植 原体脱除完全; 如果 检测为阳性, 再进行荧光显微镜观察( 见附录) 或电子显微镜观察( 见附录 ) , 如果任一方法观察到植原体的粒体, 即可判断该植株的植原体脱除不完全, 需进一步进行脱除。 结果记录与资料保存 完整的实验记录要包括: 植株的来源、 种类、 进出境时间, 实验的时间、 地点、 方法和结果等, 并要有 经手人和实验人员的签字。 检测需要有电泳图片, 荧光显微镜检查和电镜观察需有植原体的粒体 结构
9、照片。 复核 由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、 照片等资料的完整性 和真实性, 必要时进行复核实验。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 附 录 犃 ( 规范性附录) 犕 犛培养基的制备 犃 仪器设备 电子天平、 高压灭菌锅等。 犃 试剂 犃 大量元素( 母液, 倍浓缩液) 硝酸铵( ) 硝酸钾( ) 氯化钙( )
10、硝酸镁( ) 磷酸二氢钾( ) 用少量的蒸馏水彻底溶解, 最后定容到, 冰箱保存。 犃 微量元素( 母液, 倍浓缩液) 碘化钾( ) 硼酸( ) 硫酸锰( ) 硫酸锌( ) 钼酸钠( ) 硫酸铜( ) 氯化钴( ) 用少量的蒸馏水彻底溶解, 最后定容到, 冰箱保存。 犃 铁盐( 母液, 倍浓缩液) 硫酸亚铁( ) 将称好的硫酸亚铁( ) 和 分别放到 蒸馏水中, 边加热边 不断搅拌使它们溶解, 然后将两种溶液混合, 并将 调至 , 最后定容到, 保存在棕色玻璃瓶中, 冰箱保存。 犃 有机成分犃( 母液, 倍浓缩液) 肌醇 用少量的蒸馏水彻底溶解, 最后定容到, 冰箱保存。 犃 有机成分犅( 母
11、液, 倍浓缩液) 烟酸 盐酸吡哆醇( 维生素 ) 盐酸硫胺素( 维生素 ) 甘氨酸 用少量的蒸馏水彻底溶解, 最后定容到, 冰箱保存。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 犃 琼脂 犃 蔗糖 犃 犕 犛培养基的配制 犃 混合培养液的配置 用量筒或移液器从各种母液中分别取出所需的用量: 母液为 , 母液、和各 , 一起放入烧杯中。 犃 称量及溶解 分别称取琼脂, 蔗糖 , 放入的大烧杯中, 再加入蒸馏水 , 边加热边用玻
12、璃棒搅 拌, 直到液体呈半透明状; 然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中, 最后加蒸馏水定容至, 搅拌均匀。 犃 调节 狆 犎 用移液器吸取 的氢氧化钠( ) 溶液, 逐滴滴入溶化的培养基中, 边滴边搅拌, 并随时 用精密的 试纸( ) 测试培养基的 , 直到 。 犃 分装 溶化的培养基应趁热分装, 及时封盖瓶口。用块硫酸纸中间夹层薄牛皮纸封盖瓶口, 并用线绳 捆扎后贴上标签。 犃 灭菌 培养基放在高压灭菌锅中, 在 ( ) 、 条件下灭菌 。灭菌后取出锥形 瓶, 使培养基自然冷却凝固。 犃 添加植物生长调节物质 培养不同的植物, 还应根据需要在 培养基中加入植物生长调节物质: 生长素和
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