两种生物衍生材料修复兔角膜浅层缺损的初步实验研究.pdf
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1、两种生物衍生材料修复兔角膜浅层缺损的 初步实验研究 张姝江1张美霞2杨志明1罗静聪1李秀群1孟丹2 【摘 要】目的比较脱细胞冻干羊膜与脱细胞冻干牛角膜基质在修复兔角膜浅层缺损后的机体反应,以寻找 适合的组织工程角膜支架。方法新鲜健康人胎盘羊膜按罗静聪等制备方法处理,冻干后消毒备用。牛角膜经0 . 2 5 % 胰蛋白酶消化,生理盐水漂洗后,冻干,消毒备用。雌性日本大耳白兔2 0只,随机分为A、 B组,每组1 0只。常规麻醉消毒 后,采用7 . 5mm直径环钻造出约1 / 3角膜厚度的缺损。A组采用复水后的脱细胞冻干羊膜修复; B组采用脱细胞冻干牛 角膜基质修复。术后裂隙灯显微镜下观察植片和新生血
2、管状况,并于术后2 、 4 、 8周取标本, HE染色,组织学观察。结果 术后两组植片无溶解、脱落,于8周降解完全,角膜中央缺损区域大部分恢复透明。两组均有新生血管长入角膜,两组 新生血管长入范围比较,差异无统计学意义( P0 . 0 5 ) 。组织学观察2周时两组均有较重的炎性反应,成纤维细胞增生, 胶原排列紊乱; 4周时炎性反应均减轻,植片区域可以见到新生血管长入; 8周时均有较多的成纤维细胞存在,并有少量 瘢痕形成。结论脱细胞冻干羊膜与脱细胞冻干牛角膜基质修复角膜浅层缺损,仍能引起一定程度的排斥反应,需要 进一步的改进。 【关键词】 羊膜牛角膜基质组织工程角膜 中图分类号:R 7 7 2
3、 . 2 R 3 1 8文献标识码: A C O MP A R I S O NO FT WOS O R T SO FB I O- D E R I V E DMA T E R I A L SA F T E RB E I N GE X P L A N T E DI NT HER E P A I R E D R A B B I TC O R N E A LD E F E C T /Z HANGS h u j i a n g ,Z HANGMe i x i a ,Y ANGZ h i mi n g ,e t a l .Di v i s i o no fS t e mC e l l a n d T i
4、s s u eE n g i n e e r i n g ,S t a t eKe yL a b o r a t o r yo fB i o t h e r a p y ,We s t C h i n aHo s p i t a l ,S i c h u a nUn i v e r s i t y ,C h e n g d uS i c h u a n , 6 1 0 0 4 1 , P. R . C h i n a C o r r e s p o n d i n ga u t h o r : Y a n gZ h i mi n g ,E - ma i l : o r t h o p p u
5、b l i c . c d . s c . c n 【 A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T oc o mp a r et h ee f f e c t so f t h ed e n u d e df r e e z e - d r i e d - a mn i o t i c - me mb r a n ea n dt h ed e n u d e d f r e e z e - d r i e db o v i n ec o r n e a l s t r o mawh e nt h e ywe r ee x p l a n t e dt or e p
6、 a i rt h ec o r n e a l d e f e c to fr a b b i t s .Me t h o d s T h e a mn i af r o m h e a l t h yh u ma np l a c e n t a ewe r ep r e p a r e dwi t ht h eme t h o dr e p o r t e db yL UO J i n g c o n g ,wh i c hwe r ef r e e z e - d r i e da n ds t e r i l i z e d .T h eb o v i n ec o r n e aw
7、a sa l s od e n u d e db yt y p s i n ,r i n s e d ,f r e e z e - d r i e d ,a n ds t e r i l i z e d .T we n t yJ a p a n r a b b i t swe r ed i v i d e di n t og r o u pA( t h ea mn i o n t i c g r o u p )a n dg r o u pB ( t h eb o v i n e - c o r n e a l - s t r o mag r o u p )a t r a n d o m.T h
8、 e d e f e c t wa sma d e ,wh i c hwa s7 . 5mm i nd i a me t e r a n d1 / 3o f t h et h i c k n e s so f t h ec o r n e a ,a n dt h et wok i n d so f ma t e r i a l s we r ee x p l a n t e dt or e p a i rt h ed e f e c t .T h ev a s c u l a r i z a t i o na n dt h ec h a n g e so ft h eo p e r a t e
9、 de y ewe r eo b s e r v e d .T h e s a mp l e swe r et a k e na t 2 ,4a n d8we e k s f o r h i s t o l o g i c a l e x a mi n a t i o n .R e s u l t s T h ee x p l a n t e dma t e r i a l s we r en o t me l t e d o re x c l u d e d .T h e r ewe r ev i s i b l en e o v e s s e l si nb o t hg r o u p
10、 s ,y e tt h e r ewa sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t we e nt h e m. Ac c o r d i n gt ot h eh i s t o l o g i c a l o b s e r v a t i o n ,t h e r ewa ss e v e r ei n f l a mma t i o ni nb o t hg r o u p s2we e k sa f t e ro p e r a t i o n ,t h e f i b r o b l a s t swe r ep r o l
11、 i f e r a t e d ,a n dt h ec o l l a g e nf i b e r swe r ed i s o r g a n i z e d ;h o we v e r , t h er e a c t i o n sb e c a memi l d e rf r o m 4 we e k sa f t e ro p e r a t i o n s ,a n dt h en e o v e s s l e sc o u l db es e e ni ng r o u p sAa n dB ;a t 8we e k s ,t h ec o l l a g e nf i
12、b e r swe r emo r e o r g a n i z e di ng r o u p sA a n dB ;h o we v e r , t h e r ewa ss t i l l as ma l l a r e ao fd i s o r g a n i z e df i b e r sl e f t .C o n c l u s i o nT h et wo ma t e r i a l sc a nl e a dt or e j e c t i o nt os o mee x t e n t ,a n ds ot h e yn e e dt ob ei mp r o v
13、e d . 【 Ke yw o r d s 】Amn i o t i cme mb r a n eB o v i n ec o r n e a l s t r o maT i s s u ee n g i n e e r e dc o r n e a F o u n d a t i o ni t e m:Na t i o n a l Hi g hT e c h n o l o g yR e s e a r c ha n dD e v e l o p me n t P r o g r a m o f C h i n a ( 2 0 0 1 AA2 1 6 0 1 1 ) 在组织工程角膜的研究中,
14、过去采用的人工材料 大多难与宿主发生生物愈合,容易引起排斥反应、植片 基 金 项 目:国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划( 8 6 3 )资 助 项 目 ( 2 0 0 1 AA2 1 6 0 1 1 ) 作者单位: 1四川大学华西医院 生物治疗国家重点实验室干细 胞与组织工程研究室(成都, 6 1 0 0 4 1 ) , 2眼科 通讯作者:杨志明,教授,博士导师,研究方向:组织工程, E - ma i l : o r t h o p p u b l i c . c d . s c . c n 脱落和钙沉积等问题 1 - 3 。而适合的组织工程角膜支架 必须具有良好的生物相容性,具有三
15、维立体结构、良好 的细胞生长界面,从而能够作为“桥梁“诱导周围的正 常角膜上皮细胞移行到缺损区域生长以达到修复组织 的目的;还应具有生物可降解性、可塑性及机械强度等 一般载体材料的基本要求 4 ,并且有良好的透光度和 透氧性。因此,生物衍生材料作为支架材料已成为目前 364 中国修复重建外科杂志2 0 0 6年第2 0卷第4期 的探索方向。羊膜在临床广泛应用于角膜疾病的治疗, 具有良好的生物相容性 5 , 6 。脱细胞冻干羊膜具有便于 保存和消毒等特点,但目前临床及实验研究常用新鲜 或甘油保存的羊膜,而对冻干羊膜在治疗角膜缺损方 面的生物相容性及效果罕见报道。异种角膜基质则因 为具有与角膜相近
16、似的性质,是近年来国内新的研究 热点 7 。有研究表明去上皮的异种角膜基质具有较低 的免疫原性,不易引起免疫排斥反应 8 - 1 0 。 我们的研究旨在比较脱细胞冻干羊膜和脱细胞冻 干牛角膜基质用于兔眼角膜浅层缺损时修复的效果, 为构建组织工程角膜寻找更适宜的支架材料。 1 材料与方法 1 . 1 主要仪器及试剂 - 7 0 超 低 温 冰 箱( S a n y o公 司,日 本) ,g a ma 2 - 1 6L S C冻干机( C h r i s t公司, 美国) , Or i e n t解剖显 微镜、 Ni k o nY- F L图像处理系统( Ni k o n公司,日本) 。 胰蛋白酶
17、( G i b c o公司,美国) 。 1 . 2 脱细胞羊膜与脱细胞牛角膜基质的制备 羊膜来自健康产妇自愿捐赠的新鲜胎盘,按罗静 聪等 1 1 方法处理后,环氧乙烷消毒备用。牛角膜取自 本地健康4岁黄牛(成都郫县标准化屠宰场提供) ,共 1 0只。将牛角膜反复清洗后, 0 . 2 5 %胰蛋白酶室温下 脱细胞1h ,生理盐水漂洗3d 。-7 0 超低温预冻后, 经冻干机冻干处理,环氧乙烷消毒备用。两种材料经生 理盐水浸泡复水1h ,用7 . 5mm环钻修整羊膜为直径 7 . 5mm植片; 修整牛角膜基质为直径7 . 5mm,约1 / 3 兔角膜厚度的植片,待用。 1 . 3 实验动物及分组
18、日本大耳白兔2 0只,雌性,体重2 3k g (四川大 学实验动物中心提供) 。随机分为A、 B组,每组1 0只, 以右眼为术眼。3 %戊巴比妥钠按3 0mg / k g体重耳缘 静脉注射,同时予以倍诺喜(参天制药,日本)滴眼麻 醉,兔眼周围消毒,铺巾,开睑器开睑。解剖显微镜下, 选用7 . 5mm直径环钻制造角膜浅层中央部缺损,剥 去约1 / 3角膜厚度。两组动物分别用复水后的脱细胞 冻干羊膜( A组)与脱细胞冻干牛角膜基质( B组)修复 缺损,以1 0 - 0尼龙缝线取3 、 6 、 9 、及1 2点钟方位4处缝 合植片,并在各象限内间断缝合2针以固定植片。术后 1 %地塞米松滴眼液以及氯
19、霉素滴眼液每日滴眼各 1次。 1 . 4 检测方法 1 . 4 . 1 大体观察 术后每周裂隙灯显微镜下观察术眼角膜是否水 肿、植片是否溶解或脱落、有无新生血管长入。于术后 2 、 4 、 8周,将新生血管分为周边(在缝线周围不超过缝 线) , 1 +(超过缝线未超过角膜1 / 3 ) , 2 +(侵犯超过角 膜1 / 3未超过2 / 3 ) , 3 +(侵犯超过角膜2 / 3 )进行评估。 1 . 4 . 2 组织学观察 于术后2 、 4 、 8周分别处死动物,每组3只。取下术 眼,剪取角膜,多聚甲醛固定后,将角膜从中间切为两 半,以断面为切片面用石蜡包埋。 5 m厚度连续切片, 每个标本5
20、张,取3张作HE染色观察。 1 . 5 统计学方法 采用S P S S 1 0 . 0统计软件包进行统计学分析,组间 比较采用秩和检验, P值0 . 0 5 ) ,见 表1 。 2 . 2 组织学观察 术后2周: A、 B组缺损区及周围均可见基质中有 大量炎性细胞浸润,多为中性粒细胞,角膜基质中有大 表1各时间点两组新生血管范围比较 T a b .1 C o mp a r i s o no f t h er a n g e s o f n e o v e s s e l s b e t w e e ng r o u pAa n dg r o u pB 组别 G r o u p 2周 2we e
21、 k s 周边 1 +2 +3 + 4周 4we e k s 周边 1 +2 +3 + 8周 8we e k s 周边 1 +2 +3 + A630022200210 B630012300030 464C h i n e s eJ o u r n a l o f R e p a r a t i v ea n dR e c o n s t r u c t i v eS u r g e r y ,2 0 0 6 ,Vo l 2 0 ( 4 ) 量成纤维细胞增生(图4 ) ;植片与周围组织融合, A组 仍可见边界, B组与周围角膜胶原无明显边界。4周: 两组均可见从缺损区周围的上皮覆盖区域有角膜上皮
22、 爬行到缺损区进行修复, B组见长入角膜基质的新生 血管,基质中长入较多成纤维细胞,缺损区角膜基质 胶原排列紊乱(图5 ) ;羊膜和牛角膜基质植片与周围组 织均已无间隙,角膜基质细胞长入其间。8周:可见上 皮修复已经完成,缺损区已完全被角膜上皮覆盖。 B组 仍可见角膜基质中有明显的新生血管,而A组中新生 血管则少见。两组缺损区域,角膜基质中仍有增生的成 纤维样细胞,但比早期有明显减少,胶原的排列更趋于 有序(图6 ) 。 图1术后2周大体观察,缝线周围有新生血管长入,植片无溶解和脱落 aA组bB组 图2术后4周大体观察,新生血管越过缝线区域向 中央瞳孔区长入,植片已部分降解 aA组bB组 图3
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