二烯丙基二硫对人结肠癌HT29细胞G1期的阻滞作用.pdf
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1、二烯丙基二硫对人结肠癌 HT-29 细胞 G1期的阻滞作用 黄幼生, 苏 琦, 周秀田, 苏 坚, 廖前进, 解 娜, 葛 玲 (南华大学肿瘤研究所, 湖南 衡阳 421001) 收稿日期: 2004 -12 -20, 修回日期: 2005 -02 -26 作者简介: 黄幼生 (1975 - ) , 男, 硕士, Tel:0734-8281510, E-mail: hys768811 yahoo. com. cn; 苏 琦 (1947 - ) , 男, 教授, 博士生导师, 研究方向: 肿瘤 病因发病学及防治, 通讯作者, Tel: 0734-8282547, E-mail: suqi1945
2、 yahoo. com. cn 中国图 书 分 类 号: R 329. 28; R 341; R 394. 2; R 73-351; R 735. 350. 22; R 977. 6 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2005) 09 -1128 -05 摘要: 目的 探讨二烯丙基二硫 (DADS) 对人结肠癌 HT-29 细胞 G1期的阻滞作用及分子机制。方法 采用 MTT、 细胞 计数法、 流式细胞术和免疫细胞化学方法分析 DADS 对体外 培养的 HT-29 细胞增殖抑制作用、 细胞周期分布及细胞周期 相关蛋白表达的影响。结果 MTT 法显示, 60、 120 mol
3、 L -1 DADS 作用 HT-29 细胞24 h 后, 生长抑制率分别达23. 1 %、 45. 6%。细胞计数法表明, 常规培养 HT-29 细胞群体倍 增时间为22. 58 h , 60 molL -1 DADS 作用 HT-29 细胞后, 其细胞群体倍增时间延长到 31. 20 h。流式细胞仪分析结果 显示, 60 molL -1 DADS 阻滞 HT-29 细胞在 G1期, 与对照 组相比, 可使 G1期细胞增加约 2 倍, 而 120 molL -1 DADS 显著地将细胞阻滞在 G2/ M 期。免疫细胞化学分析表 明在 G1期阻滞同时有 p21Waf1蛋白表达上调, Cycli
4、n E、 C-myc 蛋白表达下降。结论 低剂量 DADS 对 HT-29 细胞的抑制 增殖作用可能与 G1期阻滞有关, DADS 对 HT-29 细胞 G1期 阻滞的分子机制可能与调节 p21Waf1、Cyclin E、 C-myc 表达相 关。 关键词: 二烯丙基二硫; 结肠癌; HT-29 细胞; 细胞周期; cyc- lin E 蛋白 结肠癌 (Colon cancer) 是消化道常见的恶性肿 瘤, 其发生率和死亡率有逐渐上升的趋势。大量的 流行病学和实验性研究证明, 大蒜及其烯丙基硫化 物能抑制多种化学致癌物诱发的乳腺癌、 皮肤癌、 肝 癌、 肺癌、 食管癌、 结肠癌 1。本实验室先
5、前研究证 实, 大 蒜 中 的 二 烯 丙 基 二 硫 ( diallyl disulfide , DADS)对胃癌 MGC-803、 白血病 HL-60 细胞有周期 阻滞及生长抑制作用 2 4; 可诱导白血病 HL-60、 胃 癌 MGC- 803 细胞向成熟方向分化 3, 4。研究表明 DADS 能促使结肠癌细胞发生周期阻滞, 抑制肿瘤 细胞的增殖, 诱导癌细胞凋亡, 但其防治肿瘤的作用 机理尚未完全阐明 5, 6。 近年来, 许多研究证明抗肿瘤药物可通过将肿 瘤细胞停滞在 G0/ G1、 G2/ M 期来抑制肿瘤的增生。 目前, 研究细胞周期控制机制来寻找肿瘤防治的靶 点已成为研究热点。
6、本文以人结肠癌细胞系 HT-29 细胞作为研究对象, 观察 DADS 对 HT-29 细胞的抑 制增殖作用和细胞周期调控作用, 探讨低剂量 DADS 是否通过对 HT-29 细胞 G1期阻滞来抑制细 胞进入 S 期, 从而达到抑制增殖作用, 并进一步探讨 周期相关蛋白动态变化与肿瘤细胞周期表型改变的 关系。 1 材料与方法 1. 1 药品及试剂 DADS: Fluka 公司产品, d420 = 110, Mr146128, 纯度 80%, 含 10% 20% DAS。 DADS 与 Tween80 以 1: 2 的比例充分溶解后, 加入 体积分数为 0. 90 的无菌生理盐水稀释 100 倍,
7、 震荡 混匀, 作为母液保存于 -20冰箱中, 临用时将此母 液稀释至所需浓度。MTT、 RNase 为 Amresco 公司 产品。PI (propidium iodide,碘化丙啶)为 Sigma 公 司产品。p21Waf1、 C-myc、 Cyclin-E 单克隆抗体 均为 Santa Cruz 公司产品。Ultrasensitive TMS-P Kit 为 Maxim 公司产品。DAB Kit 购于福州迈新公司。 1. 2 细胞培养 HT-29 细胞 (人结肠中分化腺癌, 从中国典型培养物保藏中心引进) 用体积分数为 10%小牛血清的 RPMI-1640 培养基, 37, 体积分 数为
8、 5% CO2温箱中培养。取对数生长期细胞用于 实验。DADS 加入培养基前用 Tween 80 溶解, 以加 有与最高浓度组中等量 Tween 80 作为溶媒对照组, Tween 80 在培养基中最高体积分数低于 0. 01 %。 1. 3 MTT 实验 取对数生长期细胞, 常规胰酶消 化制成单细胞悬液, 接种于 96 孔平底培养板, 待培 养 24 h 后, 加入处理因素, 设立 0 对照、 空白对照和 处理组, 每组取6 个复孔, 继续培养24 h。然后每孔 加入 20 l 的 5 gL -1的 MTT/ PBS 溶液, 再培养 4 h 后除去上清液, 每孔加入 100 l 的 DMSO
9、, 振荡摇 匀, 使结晶充分溶解。置酶联免疫仪上测各孔吸光 度, 检测波长 570 nm , 按下列公式计算抑制率: 抑制率 (IR%) = (1 - 处理组平均吸光度值/ 对照组平均吸 光度值)100% 8211中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Sep; 21 (9) : 1128 32 1. 4 细胞计数 取对数生长期 HT-29 细胞以 2. 5 107L -1均匀接种到 24 孔板, 培养 24 h 后用台 盼蓝排斥法计数细胞, 作为处理前细胞数。加入不 同浓度 DADS 作用 48 h 后分别离心收集, 用台盼蓝 排斥法观察细
10、胞毒性, 并计算药物对细胞群体倍增 时间的影响。 细胞群体倍增时间按公式 TD = t lg2/ lg (Nt/ N0)计算 (Nt为 t 时间的细胞数, N0为处理前细胞 数) 。 1. 5 流式细胞术检测 不同浓 DADS 处理 HT-29 细胞 24 h 后收集细胞, 4体积分数为 70% 乙醇固 定, -20冰箱保存。检测前, PBS 洗 3 次, 然后加 RNase A 50 l(0. 5 gL -1)37 1 h, 再加入 PI 50 l(1 gL -1)4避光染色 30 min 后使用 Coulter Epics XL/ XL -MCL 型流式细胞仪(美国 Beckman Cou
11、lter Inc 产品)进行检测,以控制组细胞 DNA 倍 体作为内标准。应用 CELLquest 软件进行解析, 分 析 DNA 含量, 检测群体细胞中 G1、 S、 G2/ M 期细胞 百分率 (实验重复 3 次) 。 1. 6 免疫细胞化学分析 观察 DADS 处理 HT-29 细胞 24 h 后, 多种细胞周期相关蛋白表达改变情 况。取对数生长期细胞, 常规胰酶消化制成单细胞 悬液, 接种于 6 孔平底培养板 (盖片培养) 。待培养 24 h 后, 加入处理因素, 设立0 对照、 PBS 对照、 和处 理组 (60 molL -1 DADS) , 继续培养 24 h。24 h 后以冷
12、PBS (0. 01 molL -1, pH 7. 2) 冲洗盖片细胞 面3 次, 每次5 min; 95%乙醇固定20 min; 每张盖片 加50 l 过氧化酶阻断剂室温孵育10 min; PBS 冲洗 3 次, 每次5 min; 每张盖片加50 l 非免疫性动物血 清, 室温孵育 5 min; PBS 洗 1 次 5 min; 每张盖片 加 50 l 一抗, 4过夜; PBS 洗 3 次 5 min; 每张盖 片加 50 l 链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶溶液, 室 温孵育 10 min; PBS 洗 3 次 5 min; 每张盖片加 100 l 新鲜配制的 DAB 溶液, 显色5 10 m
13、in; 自来水冲 洗, 苏木素浅染, 酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封 片。 1. 7 统计学方法 结果采用 SPSS12. 0 统计学软件 进行分析, 用 x2检验, t 检验比较处理组与对照组的 区别, P 0. 05) 。Fig 1 显示, 60 molL -1 DADS 对 HT-29 细胞的抑制效应呈现明显的时间依赖性 (P 0. 05)。 2. 3 DADS 对 HT-29 细胞周期的影响 流式细胞 术检测结果显示 (Tab 3, Fig 2) : 与未处理组细胞周 期分布相比, 30、 60 molL -1 DADS 作用 HT-29 细 胞 24 h 后, G1期 百 分
14、率 分 别 增 加 到 35. 8%、 45. 2%, 60 molL -1 DADS 与对照组 27. 6% 相比 P 0. 05) 。当 DADS 浓度增加到 90 molL -1时 G 2/ M 期细胞比例升高, 当达到 120 molL -1时则有显著的 G 2/ M 期阻滞作用 (P 0. 01) , 与 Knowles 等的研究结果一致。说明 60 molL -1 DADS 可能是通过将细胞阻滞在 G1期来 发挥抑制肿瘤细胞增殖作用。 大量实验证据表明, 许多抗癌药物对细胞周期 有特异的阻断作用 8, 这种作用受多种调控基因精 细而又复杂的相互调控, 这些基因最终是通过其表 达的蛋
15、白实现对细胞增殖表型的直接调节, 我们的 流式细胞术结果表明低剂量 DADS 可以将人结肠癌 HT-29 细胞阻滞在 G1期, 因此本实验研究与 G1期相 关的细胞周期蛋白的改变。 在人类细胞中, cyclin E-CDK2 复合物是细胞周 期中 G1期向 S 期转换过程中重要的周期依赖性激 酶, cyclin E 的过表达促进 G1/ S 的转换, 它的表达 下调或缺失则使细胞停滞于 G1期。p21 是 p53 的 一个下游基因, 属 CDKI 家族, 可抑制 CDK1、 CDK2、 CDK4、 CDK6, 被认为是细胞周期内通用性抑制物, 它的表达增加抑制 G1期 cyclin E-CDK
16、2 复合物活 性, 降低 cyclin E 蛋白的表达, 阻滞细胞于 G1期。许 多抗肿瘤药物能通过诱导 p21 的表达增高, 从而抑 制 G1期 cyclin E-CDK2 复合物活性, 降低 cyclin E 蛋 白的表达, 阻滞细胞于 G1期 9, 10。研究发现, DADS 能诱导 p21Waf1表达增强 11。我们的结果显示, 60 molL -1 DADS 能诱导 p21Waf1在 HT-29 细胞中的 表达;在 p21Waf1表达增高的同时伴随着 cyclin E 蛋 白表达的降低。表明低剂量的 DADS 阻滞细胞于 G1期可能是通过诱导 p21Waf1表达, 抑制 cyclin
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- 丙基 结肠癌 HT29 细胞 G1 阻滞 作用
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