二氢青蒿素抑制结肠癌细胞株HCT-116并诱导凋亡的实验研究.pdf
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1、第2 l 卷第7 期航空航天医药 2 0 1 0 年7 月 1 0 8 3 论著 二氢青蒿素抑制结肠癌细胞株H C T 一1 16 并 诱导凋亡的实验研究 朱奔奔1 ,谢东2 ( 1 上海中医药大学。上海2 0 0 0 3 1 ;2 中科院上海生命科学院营养所,上海2 0 0 0 3 1 ) 摘要目的:研究二氢青蒿素( D i h y d r o a r t e m i s i n i n ,D H A ) 对人结肠癌H C T 1 1 6 细胞的体外抑制并诱导凋亡, 并探讨其作用机制。方法:以不同浓度的D H A 作用于体外培养的H C T 一1 1 6 细胞,采用四甲基偶氮唑盐比色法 (
2、M ,I r 法) 检测细胞生长抑制率;应用流式细胞仪进行周期分析检测细胞凋亡情况;用W e s t e r nB l o t t i n g 法,检测不 同浓度的D H A 作用于肿瘤细胞时,凋亡相关蛋白B c l 一2 ,b a x ,c l e a v a d P A R P 表达情况。结果:在D H A 作用后, H C T 一1 1 6 细胞生长受到明显抑制,I C 。( 半抑制浓度) 值为1 4 1 8p m o L L 。并呈一定的量效和时效依赖关系。流 式细胞仅检测亚二倍体( s u b G 。) 比例增高;W e s t e r n B l o t t i n g 检测药物处
3、理细胞后B c l 一2 表达水平下调,而 B a x 、c l e a v a d P A R P 表达水平明显上调。结论:D H A 能抑制H C T 一1 1 6 细胞的生长增殖并诱导细胞发生凋亡。 关键词二氢青蒿素;结肠癌细胞株H C T 一1 1 6 ;细胞凋亡 d o i :1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 0 0 5 9 3 3 4 2 0 1 0 0 7 0 0 1 中图分类号:R 一3 3 2 文献标识码:A E f f e c to fD i h y d r o a r t e m i s i n i no nA p o p t o s i sa n dC e
4、 l lG r o w t hI n h i b i t o r y i nH u m a nC o l o nC a n c e rH C T 一11 6C e l l s Z H UB e n b e n ,X I ED o n g ( T h eS h a n g h a iT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c a lU n i v e r s i t y ,S h a n g h a i2 0 0 0 31 ,C h i n a ) A b s t r a c tO b j e c t i v e :T oi n v e s t i g
5、 a t et h ee f f e c to fd i h y d r o a r t m i s i n i no na p o p t o s i sa n dc e l lg r o w t hi n h i b i t o r yi nH u - m a nC o l o nc a n c e rH c t l16c e l l sc u l t u r e di nv i t r o M e t h o d s :H C T 一11 6c e l l sw e r et r e a t e dw i t hD H Aa tv a r i o u se o n c e n t r a
6、 - t i o n sa n dd e t e r m i n e df o rp r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i n gr a t eb yM T Ym e t h o d T h ea p o p t o s i si n d u c t i o nw a se x a m i n e db yf l o wc y t o m e t r y T h ee x p r e s s i o no ft h eB c l 一2 ,b a x ,c l e a v a d P A R Pw h i c ha s s o c i a t e dw i
7、 t hc e l la p o p t o s i sw e r em e a s u r e db yW e s t e m B l o t t i n g R e s u l t s :D H As h o w e ds i g n i f i c a n t l yt i m e a n dd o s a g e d e p e n d e n ti n h i b i t o u ye f f e c to nt h ep r o l i f e r a t i o no f H C T 一11 6c e l l s ,t h eI C 5 0v a l u e sw e r e1
8、4 1 8 斗m o L LF l o wc y t o m e t r yd e m o n s t r a t e dt h a tt h ep e r c e n t a g eo ft h ec e l l si n S u b G op h a s ei n c r e a s er e m a r k a b l ya f t e rt r e a t e dw i t hD H A W e s t e r n B l o t t i n ga l s or e v e a l e dt h a tD H Ad o w n r e g u l a t e d B c l 一2 ,u
9、 p r e g u l a t e dB a xa n dc l e a v a d P A R EC o n c l u s i o n s :D H Ac a l li n d u c ea p o p t o s i sa n di n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no f H C T 一11 6c e l l ss i g n i f i c a n t l y K e yw o r d sD i h y d r o a r t m i s i n i n ( D H A ) ;H u m a nC o l o nc a n c e r
10、 ;H c t l l 6 ;C e l l s ;A p o p t o s i s 青蒿索( a r t e m i s i n i n ) 为我国首次从黄花蒿中提取的一 种高效低毒抗疟药。近期研究发现,青蒿素及其衍生 基金项目:浦江人才计划资助( 0 6 P J l 4 1 0 8 ) 作者简介:朱奔奔( 1 9 6 2 一) ,男,博士研究生,讲师;主要 从事中医药防治肿瘤的研究。 通讯作者:中国科学院上海生命科学研究院营养所研究 员、教授、博士生导师,主要从事肿瘤分子生物 学研究。 物”。对多种肿瘤细胞均有一定的抑制作用,二氢青蒿素 ( D i h y d r o a r t e m
11、 i s i n i n ,D H A ) 为青蒿素类药物在体内的主要 活性代谢产物,与其他青蒿素类药物相比显示出更强的抗 肿瘤活性。本实验观察了D H A 对人结肠癌H C T 1 1 6 细 胞增殖抑制及诱导凋亡的作用,并初步探讨其机制。 1 材料与方法 1 1 药物和试剂二氢青蒿素( 标准品) 购自上海融禾医 药科技发展有限公司,临用前用二甲亚砜( D M S O ) 溶解,所 有实验中D M S O 终浓度 0 1 ;鼠抗人B c l 一2 、鼠抗人 万方数据 10 8 4 V 0 1 21 N o 7 A e r o s p a c eM e d i c i n e J u l2 0
12、 1 0 B a x 、B a c t i n 等抗体均为S a n t aC r u z 产品;R P M I 一1 6 4 0 细 胞培基为G i b c o 公司产品;1 0 胎牛血清为美国F r o n t 公司 产品;O 2 5 的胰酶、噻唑蓝( M T r ) 为美国S i g m a 公司产 品。 1 2 材料和仪器细胞培养箱为H e r a e u s 公司产品;恒温 水浴箱( 1 S O T E M P 姜堰市新康医疗器械公司) ;超净工作台 ( 苏州净化设备厂) ;M u h i f u g e 3 型离心机( H e r a e u s 公司) ; C K 4 1 型倒置
13、显微镜( o l y m p u s 公司) ;流式细胞仪( B a e t o n D i c n a t i o n 公司) 。 1 3 细胞培养结肠癌H C T 一1 1 6 细胞株购自中科院上海 生命科学院细胞生化所。将细胞株培养于含1 0 胎牛血清 的1 0 0U m L 青霉素1 0 0U m L 链霉素的R P M I 一1 6 4 0 培养皿 中,置培养箱( 恒温3 7 ,5 C O :,饱和湿度) 中,每2 1 4h 更换 1 次培养液。2 3d 传代1 次。当培养的细胞总数经细胞计 数达lX1 07 以上时,以胰酶消化、离心收集细胞。 1 4 细胞生长抑制率测定采用M 1
14、1 法进行检测。取对 数生长期的H C T 一11 6 细胞接种于9 6 孔培养板中,每孔含 细胞5 1 0 3 ,培养1 2h 后加入适当浓度的D H A ,浓度分别 为1 、5 、1 0 、2 5 、5 0 、1 0 0 “m o L L ,每组样本设3 个复孔,空白 对照组加入等体积的D M S O ,培养( 恒温3 7 ,5 C O :,饱 和湿度) 4 8h ,弃上清液,每孔中加入M ,r r 溶液( 5 嚣L ) 2 0 此,于3 7 继续孵育4h ,终止培养,小心吸弃孑L 内上清 液,每孔加入D M S O1 0 0m L 振荡,1 0r a i n 后比色,选择 5 7 0N
15、m 为测定波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收 值( O D ) ,记录结果。抑制率= ( 1 一试验组O D 值空白组 O D 值) X1 0 0 。I C 。值由I c 。值计算软件求出。试验重 复3 次。然后同样方法种植肿瘤细胞,分别设空白对照组 和药物处理组,药物组用求得的I c 。浓度D H A 处理2 4 、4 8 、 7 2h 后,再按同样方法测各孑L 光吸收值,计算细胞生长率。 1 5 流式细胞仪测定细胞凋亡取对数生长期结肠癌细 胞H C T 一1 1 6 ,以每孔4 1 0 5 个细胞种于6 孔板,分别设空 白对照组a ( 加入与药物等体积的D M S O ) ,药物作用组
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